يعالج هذا البروتوكول بعض القضايا الرئيسية الموجودة في توليد المواد العضوية مثل المتانة والموثوقية ، وتمكنا من تطبيق هذه المواد العضوية المحسنة على الأبحاث المبتكرة حول الشيخوخة العصبية. عدم التجانس والتكاثر هي قضايا مهمة عند توليد عضويات الدماغ القشرية . للتغلب على هذه ، نقوم أولا بتمييز hPSCs إلى مستعمرات عصبية خارجية ثم كرويات ظهارية عصبية ، والتي تولد بنية أنسجة قابلة للتكرار.
تبدأ هذه المواد العضوية القشرية في الدماغ في إظهار علامات نموذجية للشيخوخة بعد زراعة طويلة في المختبر ، مما يجعلها منصة مفيدة لدراسة العمليات العصبية المرتبطة بالشيخوخة. للبدء ، قم بلوحة مستعمرات hPSC على مصفوفة غشاء قبو مؤهل hESC من بئر واحد من لوحة من ستة آبار عند التقاء 60٪ في ثلاثة آبار لتحقيق كثافة 20 إلى 30٪ ثم المضي قدما في تحريض المستعمرات العصبية ثنائية الأبعاد. أضف وسيط N2 طازجا مكمل بمثبطات SMAD مزدوجة يوميا إلى كل بئر خلال الأيام الثلاثة القادمة.
لتوليد كرويات ثلاثية الأبعاد عصبية خارجية الجلد من مستعمرات ثنائية الجلد العصبية المستحثة ، قم بإزالة ملليلتر من وسط N2 من لوحة البئر الستة واغسلها مرة واحدة باستخدام HBSS لضمان إزالة كل وسط N2. أضف ملليلتر واحد من dispase إلى كل مستعمرة تحتوي على بئر. احتضن الطبق لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتحقق من انفصال المستعمرة بانتظام.
في نهاية الحضانة ، لوقف نشاط إنزيم dispase ، أضف ملليلتر واحد من وسط N2 إلى البئر. باستخدام طرف ماصة P1000 واسع التجويف أو طرف ماصة P1000 معدل مقطوع بمقص معقم ، انقل المستعمرات إلى أنبوب 15 ملليلتر واسمح لكتل المستعمرة بالغرق في قاع الأنبوب بجاذبية. ثم باستخدام طرف ماصة P1000 قياسي ، قم بإزالة السوبرناتانت بعناية.
استبدله بملليلتر واحد من وسط N2 الطازج وكرر الغسيل ثلاث مرات لضمان الإزالة الكاملة للديسباس. بعد تعليق كتل الخلايا ووسط N2 ، انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من صفيحة البئر الستة وأضف 40 نانوغرام لكل ملليلتر من bFGF. بعد التقسيم المبرد للعضويات ، قم بإزالة محلول التركيب الزائد عن طريق نقل الشرائح إلى حاوية تلطيخ الشرائح بغطاء وغسل الأنسجة العضوية المجزأة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم احتضن الشرائح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية باستخدام محلول تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز الطازج. اغسل الأنسجة الملطخة ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة لإزالة محلول بيتا غالاكتوزيداز. الآن قم بتركيب الأنسجة المغسولة باستخدام حامل زجاجي مضاد للتلاشي واسمح لمحلول التركيب بالتصلب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل مشاهدته تحت المجهر.
قبل التمايز العصبي الخارجي ، أظهرت مستعمرات hPSC مورفولوجيا أحادية الطبقة مسطحة ضيقة دون خلايا متمايزة تلوث المستعمرات. أكد تعبير NANOG أيضا تعدد قدرات مستعمرات hPSC. بعد تمايز مستعمرات hPSC إلى مستعمرات عصبية ، لوحظ مورفولوجيا أطول على شكل عمود ، وكانت سلبية ل NANOG.
بعد العلاج المنفصل والتعرض ل FGF2 في N2 ، تكاثرت الخلايا الجذعية العصبية في هذه الكرويات وشكلت عددا كبيرا من الورود العصبية التي أظهرت القطبية القمية القاعدية للكروية عن طريق التعبير عن Z01 في الخلايا في المركز والحافة الخارجية للكروية. بمجرد تضمينه ، يتكاثر الكروي بسرعة ويبدأ في التبرعم ، كما يتضح من وجود عقد الأنسجة المدمجة وتمددها إلى الخارج من الجسم الرئيسي بين أسبوع إلى ثلاثة أسابيع ، وهو ما أكده التحليل الكمي وزاد قطر الكروية بشكل كبير على مدى ثلاثة أسابيع. أكد تلطيخ التألق المناعي وجود خلايا السلف العصبية وعلامات الطبقة القشرية في المواد العضوية ذات الطبقات الواضحة ، والتي كان يمكن ملاحظتها عبر نقاط زمنية مختلفة.
كما تمت دراسة تأثير العمليات المتعلقة بالشيخوخة العصبية على الدماغ. مع مرور الوقت ، لوحظت زيادة كبيرة في وجود الشيخوخة المرتبطة بيتا غالاكتوزيداز وفي الأسبوع 13 ، تم الكشف عن وجود p21 ، مما يدل على الشيخوخة. من المهم التأكد من إزالة جميع الفراغات الزائدة وفصل المستعمرات العصبية الجلدية السليمة وإعادة زرعها بلطف لتشكيل كرويات صحية.
هذه المنصة من فرصتنا الفريدة لدراسة بيولوجيا شيخوخة الدماغ البشري ، كما أنها تسمح بإجراء بحث حول تطور الدماغ الحرج ، شريطة أن يتم استزراع هذه المواد العضوية باستخدام مفاعل حيوي.
