Dieses Protokoll befasst sich mit einigen Schlüsselproblemen der Organoiderzeugung wie Robustheit und Zuverlässigkeit, und wir konnten diese verbesserten Organoide auf innovative Forschungen zum neuronalen Altern anwenden. Heterogenität und Reproduzierbarkeit sind wichtige Themen bei der Erzeugung kortikaler Gehirnorganoide. Um diese zu überwinden, differenzieren wir hPS-Zellen zunächst in neuroektodermale Kolonien und dann in neuroepitheliale Sphäroide, die eine reproduzierbare Gewebearchitektur erzeugen.
Diese kortikalen Gehirnorganoide zeigen nach einer längeren In-vitro-Kultur typische Anzeichen von Seneszenz, was sie zu einer nützlichen Plattform für die Untersuchung alterungsbedingter neuronaler Prozesse macht. Um zu beginnen, die hPSC-Kolonien auf einer hESC-qualifizierten Basalmembranmatrix von einer Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen bei 60% Konfluenz in drei Vertiefungen zu platten, um eine Dichte von 20 bis 30% zu erreichen, und dann mit der Induktion von 2D-neuroektodermalen Kolonien fortfahren. Fügen Sie in den nächsten drei Tagen täglich frisches N2-Medium hinzu, das mit dualen SMAD-Inhibitoren zu jeder Vertiefung ergänzt wird.
Um 3D-neuroektodermale Sphäroide aus induzierten neuroektodermalen 2D-Kolonien zu erzeugen, entfernen Sie zwei Milliliter N2-Medium aus der Sechs-Well-Platte und waschen Sie sie einmal mit HBSS, um sicherzustellen, dass das gesamte N2-Medium entfernt wird. Fügen Sie einen Milliliter Dispase zu jeder Kolonie hinzu, die gut enthält. Inkubieren Sie die Platte für 20 bis 25 Minuten bei 37 Grad Celsius und überprüfen Sie regelmäßig auf Kolonieablösung.
Am Ende der Inkubation, um die Aktivität des Dispase-Enzyms zu stoppen, fügen Sie einen Milliliter N2-Medium in die Vertiefung hinzu. Mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung oder einer modifizierten P1000-Pipettenspitze, die mit einer sterilen Schere geschnitten wird, die Kolonien in ein 15-Milliliter-Rohr überführen und die Kolonieklumpen mit Schwerkraft auf den Boden des Rohres sinken lassen. Entfernen Sie dann mit einer Standard-P1000-Pipettenspitze vorsichtig den Überstand.
Ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches N2-Medium und wiederholen Sie das Waschen dreimal, um eine vollständige Entfernung der Dispase zu gewährleisten. Nachdem Sie die Zellklumpen und das N2-Medium resuspendiert haben, übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und fügen Sie 40 Nanogramm pro Milliliter bFGF hinzu. Entfernen Sie nach der Kryosektion der Organoide die überschüssige Befestigungslösung, indem Sie die Objektträger in einen Objektträger-Färbebehälter mit Deckel geben und das geschnittene Organoidgewebe dreimal mit PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur waschen.
Dann inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 37 Grad Celsius mit frisch hergestellter Beta-Galactosidase-Färbelösung. Waschen Sie das gefärbte Gewebe dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Beta-Galactosidase-Lösung zu entfernen. Montieren Sie nun die gewaschenen Taschentücher mit einem Antifade-Mountant aus Glas und lassen Sie die Montagelösung 30 Minuten bei Raumtemperatur erstarren, bevor Sie sie unter dem Mikroskop betrachten.
Vor der neuroektodermalen Differenzierung zeigten die hPSC-Kolonien eine enge flache Monoschichtmorphologie, ohne dass differenzierte Zellen die Kolonien kontaminierten. Die Expression von NANOG bestätigte auch die Pluripotenz der hPSC-Kolonien. Nach der Differenzierung von hPSC-Kolonien in neuroektodermale Kolonien wurde eine längere säulenförmige Morphologie beobachtet, die für NANOG negativ war.
Nach Dispase-Behandlung und Exposition gegenüber FGF2 im N2 vermehrten sich die neuralen Stammzellen in diesen Sphäroiden und bildeten eine signifikante Anzahl von neuralen Rosetten, die die apikal-basale Polarität des Sphäroides durch Expression von Z01 in den Zellen in der Mitte und am äußeren Rand des Sphäroides zeigten. Einmal eingebettet, vermehrt sich das Sphäroid schnell und beginnt zu knospen, was durch das Vorhandensein der kompakten Gewebeknoten und ihre Ausdehnung vom Hauptkörper nach außen zwischen ein und drei Wochen angezeigt wird, was durch quantitative Analyse weiter bestätigt wurde und der Sphäroiddurchmesser über drei Wochen signifikant zunahm. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte das Vorhandensein von Neuro-Vorläuferzellen und kortikalen Schichtmarkern in den Organoiden mit klarer Schichtung, die über verschiedene Zeitpunkte hinweg beobachtbar war.
Die Wirkung neuronaler Alterungsprozesse auf das Gehirn wurde ebenfalls untersucht. Mit der Zeit wurde ein signifikanter Anstieg des Vorhandenseins von seneszenzassoziierter Beta-Galactosidase beobachtet und in Woche 13 wurde das Vorhandensein von p21 nachgewiesen, was auf Seneszenz hinweist. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die gesamte überschüssige Dispase entfernt wird und dass Sie die intakten neuroektodermalen Kolonien vorsichtig ablösen und neu säen, um gesunde Sphäroide zu bilden.
Diese Plattform unserer einzigartigen Gelegenheit, die Biologie eines menschlichen Gehirnalters zu studieren, ermöglicht auch eine Erforschung der kritischen Gehirnentwicklung, vorausgesetzt, dass diese Organoide mit einem Bioreaktor kultiviert werden.
