Bu protokol, sağlamlık ve güvenilirlik gibi organoid üretiminde var olan bazı önemli sorunları ele almaktadır ve bu gelişmiş organoidleri nöronal yaşlanma üzerine yenilikçi araştırmalara uygulayabildik. Heterojenlik ve tekrarlanabilirlik, kortikal beyin organoidleri üretirken önemli konulardır. Bunların üstesinden gelmek için, önce hPSC'leri nöroektodermal kolonilere ve daha sonra tekrarlanabilir doku mimarisi oluşturan nöro epitelyal sferoidlere ayırıyoruz.
Bu kortikal beyin organoidleri, uzun süreli bir in vitro kültürden sonra tipik yaşlanma belirtileri göstermeye başlar ve bu da onları yaşlanmaya bağlı nöronal süreçleri incelemek için yararlı bir platform haline getirir. Başlamak için, hPSC kolonilerini hESC nitelikli bir bazal membran matrisi üzerinden% 60 akıcılıkta altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğundan% 20 ila% 30 yoğunluğa ulaşmak için üç kuyucuğa yerleştirin ve daha sonra 2D nöroektodermal kolonilerin indüksiyonu ile devam edin. Önümüzdeki üç gün boyunca her bir kuyucuğa günlük olarak çift SMAD inhibitörleri ile desteklenmiş taze N2 ortamı ekleyin.
İndüklenmiş 2D nöroektodermal kolonilerden 3D nöroektodermal sferoidler üretmek için, altı kuyucuk plakasından iki mililitre N2 ortamını çıkarın ve N2 ortamının tamamının çıkarıldığından emin olmak için HBSS ile bir kez yıkayın. Kuyu içeren her koloniye bir mililitre dispaz ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 20 ila 25 dakika boyunca inkübe edin ve koloni ayrılmalarını düzenli olarak kontrol edin.
Kuluçka sonunda, dispase enziminin aktivitesini durdurmak için, kuyuya bir mililitre N2 ortamı ekleyin. Geniş delikli bir P1000 pipet ucu veya steril makasla kesilmiş modifiye edilmiş bir P1000 pipet ucu kullanarak, kolonileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve koloni kümelerinin yerçekimi ile tüpün dibine batmasına izin verin. Ardından standart bir P1000 pipet ucu ile süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Bir mililitre taze N2 ortamı ile değiştirin ve dispasın tamamen giderilmesini sağlamak için yıkamayı üç kez tekrarlayın. Hücre kümelerini ve N2 ortamını yeniden askıya aldıktan sonra, hücre süspansiyonunu altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve mililitre bFGF başına 40 nanogram ekleyin. Organoidleri kriyoseksiyondan sonra, slaytları kapaklı bir slayt boyama kabına aktararak fazla montaj solüsyonunu çıkarın ve kesitli organoid dokuyu PBS ile üç kez oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkayın.
Daha sonra slaytları gece boyunca 37 santigrat derecede taze yapılmış beta-galaktosidaz boyama çözeltisi ile inkübe edin. Beta-galaktosidaz çözeltisini çıkarmak için lekeli dokuları PBS ile üç kez oda sıcaklığında her biri 10 dakika yıkayın. Şimdi yıkanmış dokuları bir cam antifade mountant ile monte edin ve montaj çözeltisinin mikroskop altında görüntülemeden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
Nöroektodermal farklılaşmadan önce, hPSC kolonileri, kolonileri kirleten farklılaşmış hücreler olmadan sıkı bir düz tek katmanlı morfoloji gösterdi. NANOG ifadesi ayrıca hPSC kolonilerinin pluripotensini de doğruladı. hPSC kolonilerinin nöroektodermal kolonilere farklılaşmasından sonra, daha uzun bir kolon şeklinde morfoloji gözlendi ve bunlar NANOG için negatifti.
Dispase tedavisi ve N2'deki FGF2'ye maruz kaldıktan sonra, bu sferoidlerdeki nöral kök hücreler çoğaldı ve merkezdeki hücrelerde ve sferoidin dış kenarındaki Z01 ekspresyonu ile sferoidin apikal-bazal polaritesini gösteren önemli sayıda nöral rozet oluşturdu. Gömüldükten sonra, sferoid hızla çoğalır ve tomurcuklanmaya başlar, kompakt doku düğümlerinin varlığı ve bir ila üç hafta arasında ana gövdeden dışa doğru genişlemesi ile gösterilir, bu da kantitatif analiz ile daha da doğrulanır ve sferoid çapı üç hafta içinde önemli ölçüde artar. İmmünofloresan boyama, farklı zaman noktalarında gözlemlenebilen berrak tabakalama ile organoidlerde nöro progenitör hücrelerin ve kortikal tabaka belirteçlerinin varlığını doğruladı.
Nöronal yaşlanma ile ilgili süreçlerin beyin üzerindeki etkisi de incelenmiştir. Zamanla, yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz varlığında önemli bir artış gözlendi ve 13. haftada, yaşlanmayı gösteren p21 varlığı tespit edildi. Tüm fazla dispasın giderilmesini ve sağlıklı sferoidler oluşturmak için bozulmamış nöroektodermal kolonileri nazikçe ayırıp yeniden tohumladığınızdan emin olmak önemlidir.
Bir insan beyninin yaşlanmasının biyolojisini incelemek için eşsiz fırsatımızın bu platformu, aynı zamanda bu organoidlerin bir biyoreaktör kullanılarak kültürlenmesi şartıyla, kritik beyin gelişimi üzerine bir araştırmaya da izin veriyor.
