פרוטוקול זה מטפל בבעיה מרכזית הקיימת ביצירת אורגנואידים כמו עמידות ואמינות, והצלחנו ליישם את האורגנואידים המשופרים הללו במחקר חדשני על הזדקנות עצבית. הטרוגניות ויכולת שכפול הן בעיות משמעותיות בעת יצירת אורגנואידים במוח קליפת המוח. כדי להתגבר על אלה, אנו מבדילים תחילה בין hPSCs למושבות נוירואקטודרמליות ולאחר מכן לכדורואידים נוירו-אפיתליאליים, היוצרים ארכיטקטורת רקמות הניתנת לשחזור.
האורגנואידים המוחיים בקליפת המוח מתחילים להפגין סימנים אופייניים של סנסנציה לאחר תרבית מבחנה ממושכת, מה שהופך אותם לפלטפורמה שימושית לחקר תהליכים עצביים הקשורים להזדקנות. כדי להתחיל, צלחת את מושבות hPSC על מטריצת קרום מרתף מוסמכת hESC מבאר אחת של צלחת שש בארות ב 60% מפגש לשלוש בארות כדי להשיג צפיפות של 20 עד 30% ולאחר מכן להמשיך עם אינדוקציה של מושבות נוירוקטודרמליות דו-ממדיות. הוסיפו לכל באר מדיום N2 טרי בתוספת מעכבי SMAD כפולים מדי יום למשך שלושת הימים הבאים.
ליצירת כדוריות נוירואקטודרמליות תלת-ממדיות ממושבות נוירוקטודרמליות דו-ממדיות מושרות, הסר שני מיליליטרים של מדיום N2 מצלחת ששת הקידוחים ושטף פעם אחת עם HBSS כדי להבטיח שכל מדיום N2 יוסר. הוסיפו מיליליטר אחד של דיספנס לכל מושבה המכילה היטב. דגירו את הצלחת למשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובדקו אם יש ניתוק מושבה באופן קבוע.
בסוף הדגירה, כדי לעצור את הפעילות של האנזים dispase, להוסיף מיליליטר אחד של N2 בינוני לבאר. באמצעות קצה פיפטה P1000 רחב או קצה פיפטה P1000 מותאם שנחתך עם מספריים סטריליים, מעבירים את המושבות לצינור 15 מיליליטר ומאפשרים לגושי המושבה לשקוע לתחתית הצינור בכוח הכבידה. לאחר מכן עם קצה פיפטה P1000 סטנדרטי, הסר בזהירות את הסופרנאטנט.
החלף אותו במיליליטר אחד של N2 בינוני טרי וחזר על שטיפה שלוש פעמים כדי להבטיח הסרה מלאה של dispase. לאחר החייאה חוזרת של גושי התאים ומתווך N2, מעבירים את תרחיף התא לבאר אחת מתוך לוחית של שש בארות ומוסיפים 40 ננוגרם למיליליטר של bFGF. לאחר ההקפאה של האורגנואידים, הסירו את תמיסת ההרכבה העודפת על ידי העברת המגלשות למיכל צביעת החלקה עם מכסה ושטפו את הרקמה האורגנואידית החתוכה שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן דגירו את המגלשות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תמיסת צביעת בטא-גלקטוזידאז טרייה. לשטוף את הרקמות המוכתמות שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר את תמיסת הבטא-גלקטוזידאז. כעת הרכיבו את הרקמות השטופות עם תושבת אנטיפידה מזכוכית ואפשרו לתמיסת ההרכבה להתמצק במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני צפייה בה מתחת למיקרוסקופ.
לפני ההתמיינות הנוירואקטודרמלית, מושבות ה-hPSC הראו מורפולוגיה חד-שכבתית שטוחה הדוקה מבלי שתאים מתמיינים יזהמו את המושבות. הביטוי של NANOG אישר גם את הפלוריפוטנטיות של מושבות hPSC. לאחר התמיינות מושבות hPSC למושבות נוירואקטודרמליות, נצפתה מורפולוגיה ארוכה יותר בצורת עמוד, והן היו שליליות עבור NANOG.
לאחר דיספוזיה וחשיפה ל-FGF2 ב-N2, תאי הגזע העצביים בספרואידים אלה התרבו ויצרו מספר משמעותי של רוזטות עצביות שהדגימו את הקוטביות האפית-בסיסית של הספרואיד על ידי ביטוי של Z01 בתאים שבמרכז ובקצה החיצוני של הספרואיד. לאחר ההטבעה, הספרואיד מתרבה במהירות ומתחיל לניצנים, מה שמעיד על נוכחותם של צמתי הרקמה הקומפקטיים והתפשטותם החוצה מהגוף הראשי בין שבוע לשלושה שבועות, מה שאושר עוד יותר על ידי ניתוח כמותי וקוטר הספרואידים גדל באופן משמעותי במשך שלושה שבועות. צביעת האימונופלואורסצנציה אישרה את נוכחותם של תאי אב נוירו וסמני שכבה בקליפת המוח באורגנואידים עם שכבות ברורות, אשר נצפו על פני נקודות זמן שונות.
כמו כן נחקרה ההשפעה של תהליכים הקשורים להזדקנות עצבית על המוח. עם הזמן נצפתה עלייה משמעותית בנוכחות של סנסנציה הקשורה לבטא-גלקטוזידאז ובשבוע 13 זוהתה נוכחותו של עמ' 21, מה שמעיד על סנסנציה. חשוב לוודא שכל עודפי הדיספוזה מוסרים ושאתם מנתקים וזרמים בעדינות את המושבות הנוירואקטודרמליות השלמות כדי ליצור ספרואידים בריאים.
פלטפורמה זו של ההזדמנות הייחודית שלנו לחקור את הביולוגיה של הזדקנות המוח האנושי, היא גם מאפשרת מחקר על התפתחות מוחית קריטית, בתנאי שאורגנואידים אלה עוברים תרבית באמצעות ביוריאקטור.
