Этот новый метод сочетает в себе масс-спектрометрию подвижности ионов с молекулярным моделированием и теорией динамики реакций для определения относительной термохимии двух конкурирующих реакций диссоциации троичного комплекса. Комбинация этих методов характеризует реакционные пути реагентов и продуктов, конформационные структуры и сродство лиганда к образованию троичного комплекса с ионом металла. Это исследование моделирует реакционную способность двух потенциальных пептидных меток для очистки рекомбинантного белка, где метка реагирует с металлом, хелатированным нитрилотриаценовой кислотой в иммобилизованной колонке сродства металла.
Начните с загрузки образца объемом 2 миллилитра в 2,5-миллилитровый тупой носовой шприц и введения образца в электрораспыление инструмента с помощью шприцевого насоса прибора со скоростью потока 10 микролитров в минуту. Поместите прибор в режим с отрицательной подвижностью ионов- масс-спектрометрией, или режимом IM-MS. Определите изотопную картину массы-заряда тройного комплекса альтернативного связывания металлов с отрицательным зарядом, или комплекса амб-металл-НТА, открыв программу масс-спектрометрии и выбрав Спектр.
Затем выберите Инструменты, а затем Изотопная модель. Во всплывающем окне перечислите молекулярную формулу комплекса, установите флажок Показать заряженный ион, введите 1 для заряда отрицательного и нажмите на OK.In отображаемый изотопный рисунок комплекса, обратите внимание на самый низкий пик массы. В программном обеспечении прибора выберите Настройка, а затем Quad Profile.
Затем выберите «Ручная фиксированная» и введите массу самого низкого пика изотопного паттерна. Нажмите «Обновить» и закройте окно. Снова выберите Настройка, а затем щелкните Разрешение Quad.
Соберите отрицательные спектры ионов IM-MS, начиная с первой передачи энергии столкновения, используя 5-минутную продолжительность пробега и 2-секундное время сканирования. Повторите, чтобы собрать спектры IM-MS для каждой из других энергий столкновения. Используйте интегрированные распределения времени прибытия, или области ATD, для троичного комплекса amb-metal-NTA и двух продуктов, комплекса NTA-металл и комплекса amb-металл, для нормализации до относительной процентной шкалы.
Из реплицированной пороговой диссоциации, вызванной столкновением, или измерений TCID, найдите средние и стандартные отклонения каждой точки данных. Затем преобразуйте энергию столкновения лабораторного кадра в энергию столкновения центра масс. Для измерения поперечных сечений столкновений соберите отрицательные спектры ионов IM-MS образца поли-DL-аланина 10 ppm или PA в течение 10 минут, используя инструментальные условия работы.
Затем соберите спектры IM-MS каждого троичного комплекса в течение 5 минут. Извлеките ATD каждого из ПА и троичных комплексов и экспортируйте их файлы в программное обеспечение масс-спектрометрии с помощью опции «Сохранить время дрейфа». Найдите среднее время прибытия из максимумов соответствующих кривых ATD.
Используйте метод калибровки поперечного сечения для преобразования среднего времени прибытия в поперечные сечения столкновения троичного комплекса. В главном меню CRUNCH откройте текстовый файл GB5, содержащий энергию центра масс или относительную интенсивность продуктов, зависящую от ECM. Ответ Нет на чтение параметров.
Затем выберите Моделирование, а затем Задать все параметры. Из параметров реакционной модели выберите опцию Threshold CID по умолчанию, за которой следует RRKM с интеграцией распределения передачи энергии троичного комплекса. Введите 2 для независимых смоделированных каналов продукта и выберите Рассчитать поперечные сечения.
Для типа неконволютированной модели выберите поперечное сечение 0 Кельвинов, которое включает статистическую коррекцию кинетических сдвигов RRKM за счет временного окна 50 микросекунд от ячейки столкновения до детектора времени пролета. Для вариантов свертки выберите двойной интеграл Тирнана, который включает в себя свертку над поступательным распределением энергии между ионом тройного комплекса и газом столкновения аргона. Для метода численного интегрирования выберите квадратуру Гаусса с предварительно сохраненными поперечными сечениями.
Из вариантов ввода молекулярных параметров введите G для считывания файла структурного моделирования с вибрационными и вращательными частотами PM6 троичного комплекса. Ответ Да на вопрос: Является ли один из реагентов атомным? Запишите расположение и имя файла моделирования.
Введите 1 для заряда на ионе и 1,664 для поляризуемости газа аргона. Масса иона и масса мишени относятся к троичному комплексу и аргону соответственно и автоматически считываются из текстового файла GB5. Введите 0 для гармонических колебаний.
Нажмите Enter, чтобы прочитать константы вращения 1-D и 2-D из файла структурного моделирования. Выберите значения по умолчанию 0 для обработки затрудненного ротора и 1 для симметрии молекул. Выберите значение по умолчанию 300 Кельвинов для температуры реагента.
Выберите Интеграция для метода уменьшения плотности массива состояний. Выберите Да, чтобы усечь распределение энергии. Введите 40000 волновое число для максимальной энергии для распределения, 2 волновое число для размера бункера и 32 для числа точек распределения энергии.
В качестве параметров для модели TCID/RRKM выберите Да в поле Изменить, введите 0 в поле Фиксированное время и 0,000050 секунд в верхней границе окна обнаружения. Для канала продукта 1 выберите 1 для одного переходного состояния из параметров канала диссоциации и 0 для ни одного последовательного диссоциации. Для типа переходного состояния выберите 1 для орбиты.
Выберите G, чтобы прочитать файлы программы моделирования, содержащие параметры вращения и вибрации PM6 для комплекса amb-metal плюс продукты NTA. Введите No for:Является ли одно из состояний перехода предельного фазового пространства, или PSL TS, атомарным? Введите расположение и имя файла комплекса amb-metal.
Используйте 1,062 для масштабных частот, нажмите Enter для числа атомов и введите No for:Является ли молекула линейной? Повторите то же самое для файла моделирования, содержащего вибрационные и вращательные частоты продукта NTA. Введите описание орбитальной ТС. Введите 1,0 для заряда амб-металл-иона, а затем введите поляризуемость и дипольный момент NTA.
Выберите 0 Кельвинов для температуры вращения и заблокированный диполь для обработки орбитального переходного состояния. Вводят средние массы амб-металл-иона и NTA. Нажмите клавишу ВВОД, чтобы прочитать 1-D и 2-D вращательные константы из файлов моделирования.
Выберите 0 для затрудненных роторов, 1 для симметрии молекул и 1 для реакционного вырождения. Введите параметр Без изменений. Для канала продукта 2 выберите 1 для одного переходного состояния, 0 для нулевого для последовательной диссоциации и 1 для орбиты для типа переходного состояния.
Выберите G для чтения в файлах моделирования, содержащих параметры вращения и вибрации PM6 для NTA-металлического комплекса и продуктов AMB. Затем введите описание орбитальной ТС. Введите 1,0 для заряда комплекса NTA-металла и иона, и введите поляризуемость и дипольный момент амба. Выберите 0 Кельвинов для температуры вращения и заблокированный диполь для обработки орбитального переходного состояния.
Вводят средние массы НТА-металлического комплекса и аМБ изделий. Нажмите клавишу ВВОД, чтобы прочитать 1-D и 2-D вращательные константы из файлов моделирования. Выберите 0 для затрудненных роторов, 1 для симметрии молекул и 1 для реакционного вырождения.
Затем введите Без изменений. Для обработки неактивных 2-D вращений выберите параметры по умолчанию для статистического распределения углового момента и интегрируйте распределение P-E, G над J. Используйте значение по умолчанию 32 в количестве точек в интеграции.
В меню «Модель» выберите «Оптимизировать параметры для соответствия данным» и введите минимальную энергию и максимальную энергию для начала и завершения подгонки данных соответственно. Выберите 1 для экспериментальных стандартных отклонений моделей взвешивания. На основе полученных данных выберите минимально допустимое стандартное отклонение, обычно от 0,01 до 0,001.
Используйте значение по умолчанию для предела сходимости E0 и выберите No, чтобы удерживать любой параметр при текущем значении, 0,5 и 2,0 электронвольта для нижнего и верхнего пределов и 2 для метода производной оценки. В меню Оптимизация выберите Начать оптимизацию. Программа CRUNCH оптимизирует выбранную модель TCID с учетом экспериментальных данных.
Наконец, в меню Модель выберите дельта-H и S в T для термохимической оценки двух каналов диссоциации. На репрезентативном изображении показаны первичные структуры альтернативных пептидов, связывающих металлы A и H. Цвет выделяет потенциальные места связывания металла.
Здесь показана энергетическая зависимость для формирования ионов продуктов amb-metal и NTA-металла. Энергия столкновения центра масс, где происходит 50%-ная диссоциация троичного комплекса амб-металл-НТА, включена в графики. Репрезентативные изображения показывают динамическую модель для метода TCID с энергетическим разрешением.
Столкновения между комплексом ambH-цинк-NTA плюс аргон приводят к диссоциации к комплексу ambH-цинк и свободному NTA, или NTA-цинковому комплексу и свободным продуктам ambH. Пороговые энергии E1 и E2 приравниваются к энтальпиям диссоциации 0 Кельвинов для реакций комплекса ambH-цинк-NTA на комплекс ambH-цинк и свободный NTA, или комплекс ambH-цинк-NTA на NTA-цинковый комплекс и свободный ambH, соответственно. Здесь показаны оптимизированные для геометрии PM6 тройные комплексы A и H amb-metal-NTA.
Эти конформеры были использованы в моделировании экспериментальных данных TCID и были выбраны из других структур-кандидатов путем сравнения их электронных энергий PM6 и того, как их расчетные поперечные сечения столкновения по сравнению с IM-MS измеряли поперечные сечения столкновения. На этих изображениях изображен TCID четырех комплексов амб-металл-НТА с энергетическим разрешением. Для видов A и H здесь показаны ионы продукта amb-metal и NTA-металла с запутанным порогом CRUNCH.
Энергетические значения представляют собой энтальпии диссоциации при 0 Кельвинах для реакций amb-metal-NTA на amb-metal и free NTA, или amb-metaL-NTA на NTA-metal и free amb. Здесь показано сравнение свободных энергий ассоциации Гиббса в килоджоулях на моль и констант образования, полученных из энтальпий диссоциации, чистого нуля Кельвина, с расчетами статической механики с использованием параметров PM6. Реакция NTA-никеля и свободного амба с образованием комплекса амба-никель-НТА проявляет наивысшую константу образования и представляет собой реакцию, в которой помеченный амба белком иммобилизуется НТА-никелем внутри аффинной колонны.
Установка CRUNCH требует тщательного скрининга реагентов и продуктов для получения точных пороговых энергий. Требуется опыт молекулярного моделирования для получения структур и надежных молекулярных параметров. Общие методы, описанные здесь, могут быть разработаны для скрининга эффективности молекул, предназначенных для связывания металлических кофакторов и активных сайтов белков для блокирования ферментативных функций.
