تجمع هذه التقنية الجديدة بين مطياف الحركة الأيونية والكتلة مع النمذجة الجزيئية ونظرية ديناميكيات التفاعل لتحديد الكيمياء الحرارية النسبية لتفاعلين متنافسين للتفكك لمجمع ثلاثي. ويميز الجمع بين هذه التقنيات مسارات تفاعل المواد المتفاعلة والنواتج، والهياكل التوافقية، وتقارب الليغاند لتشكيل مركب ثلاثي مع أيون المعدن. يقوم هذا البحث بنمذجة تفاعل علامتي ببتيد محتملتين لتنقية البروتين المؤتلف ، حيث تتفاعل العلامة مع المعدن المخلب بواسطة حمض النتريلوتريكاسيتيك في عمود تقارب معدني مشلول.
ابدأ بتحميل عينة 2 ملليلتر في حقنة أنف حادة سعة 2.5 ملليلتر وحقن العينة في الرذاذ الكهربائي للأداة باستخدام مضخة حقنة الجهاز بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة. ضع الأداة في مطياف كتلة حركة الأيونات السالبة، أو وضع IM-MS. حدد نمط النظائر من الكتلة إلى الشحنة للمجمع الثلاثي الربط المعدني البديل ذو الشحنة السالبة ، أو مركب amb-metal-NTA ، عن طريق فتح برنامج قياس الطيف الكتلي واختيار الطيف.
ثم حدد الأدوات متبوعة بنموذج النظائر. في النافذة المنبثقة ، قم بإدراج الصيغة الجزيئية للمجمع ، وحدد المربع الخاص بإظهار الأيون المشحون ، وأدخل 1 لشحنة سالب واحد ، وانقر فوق OK.In نمط النظائر المعروض للمجمع ، ولاحظ أدنى ذروة كتلة. في برنامج الأداة، حدد إعداد متبوعا بملف تعريف رباعي.
ثم حدد ثابت يدوي وأدخل كتلة أدنى ذروة لنمط النظائر. انقر فوق تحديث وأغلق النافذة. مرة أخرى ، حدد إعداد ، ثم انقر فوق حل رباعي.
اجمع أطياف IM-MS الأيونية السالبة بدءا من طاقة تصادم النقل الأولى باستخدام مدة تشغيل مدتها 5 دقائق ووقت مسح ضوئي مدته 2 ثانية. كرر ذلك لجمع أطياف IM-MS لكل من طاقات التصادم الأخرى. الاستفادة من التوزيعات المتكاملة لوقت الوصول، أو مناطق ATD، للمجمع الثلاثي amb-metal-NTA ومنتجين، مجمع NTA-metal ومركب amb-metal، لتطبيع المقياس النسبي للنسبة المئوية.
من التفكك الناجم عن تصادم عتبة التكرار، أو قياسات TCID، أوجد المتوسط والانحرافات المعيارية لكل نقطة بيانات. بعد ذلك، قم بتحويل طاقة تصادم نقل إطار المختبر إلى طاقة تصادم مركز الكتلة. لقياس المقاطع العرضية للتصادم، اجمع أطياف الأيونات السالبة IM-MS لعينة poly-DL-alanine التي تبلغ 10 أجزاء في المليون أو PA لمدة 10 دقائق باستخدام ظروف التشغيل المفيدة.
ثم ، اجمع أطياف IM-MS لكل مجمع ثلاثي لمدة 5 دقائق. استخراج ATD لكل من PA والمجمعات الثلاثية وتصدير ملفاتها إلى برنامج قياس الطيف الكتلي باستخدام خيار الاحتفاظ بوقت الانجراف. أوجد متوسط أوقات الوصول من الحد الأقصى لمنحنيات ATD المقابلة.
استخدم طريقة معايرة المقطع العرضي لتحويل متوسط أوقات الوصول إلى مقاطع عرضية تصادمية للمجمع الثلاثي. من القائمة الرئيسية CRUNCH، افتح الملف النصي GB5 الذي يحتوي على طاقة مركز الكتلة، أو الكثافات النسبية المعتمدة على ECM للمنتجات. الرد لا لقراءة المعلمات.
ثم، حدد النمذجة متبوعة بتعيين كافة المعلمات. من خيارات نموذج التفاعل ، اختر خيار Threshold CID الافتراضي متبوعا ب RRKM مع التكامل عبر توزيع نقل الطاقة للمجمع الثلاثي. أدخل 2 لقنوات المنتج المستقلة التي تم نمذجتها، وحدد حساب المقاطع العرضية.
بالنسبة لنوع النموذج غير المعقد ، اختر المقطع العرضي 0 كلفن ، والذي يتضمن تصحيح RRKM الإحصائي للتحولات الحركية بسبب النافذة الزمنية 50 ميكروثانية من خلية التصادم إلى كاشف وقت الطيران. بالنسبة لخيارات الالتفاف ، اختر التكامل المزدوج ل Tiernan ، والذي يتضمن الالتفاف على توزيعات الطاقة الانتقالية بين الأيون المعقد الثلاثي وغاز تصادم الأرجون. بالنسبة لطريقة التكامل العددي، اختر التربيع الغاوسي مع المقاطع العرضية المحفوظة مسبقا.
من خيارات إدخال المعلمات الجزيئية ، أدخل G لقراءة ملف النمذجة الهيكلية مع الترددات الاهتزازية والدورانية PM6 للمجمع الثلاثي. الإجابة نعم على السؤال: هل أحد المواد المتفاعلة ذري؟ اكتب موقع واسم ملف النمذجة.
أدخل 1 للشحنة على الأيون و 1.664 لقابلية استقطاب غاز الأرجون. كتلة الأيون وكتلة الهدف هي للمجمع الثلاثي والأرجون ، على التوالي ، ويتم قراءتها تلقائيا من الملف النصي GB5. أدخل 0 للاهتزازات التوافقية.
اضغط على Enter لقراءة الثوابت الدورانية 1-D و 2-D من ملف النمذجة الهيكلية. حدد القيم الافتراضية 0 لمعالجات الدوار المعيقة و 1 لتماثل الجزيئات. اختر 300 كلفن الافتراضي لدرجة حرارة المادة المتفاعلة.
حدد التكامل لطريقة تقليل كثافة صفيف الحالات. حدد نعم لاقتطاع توزيع الطاقة. أدخل رقم الموجة 40000 للحصول على الحد الأقصى للطاقة للتوزيع، ورقم الموجة 2 لحجم الصندوق، و32 لعدد النقاط في توزيع الطاقة.
بالنسبة لمعلمات طراز TCID/RRKM، اختر نعم للتغيير، وأدخل 0 للوقت الثابت، و0.000050 ثانية للحد الأعلى لنافذة الكشف. بالنسبة لقناة المنتج 1، حدد 1 لحالة انتقال واحدة من خيارات قناة التفكك و0 لأي من التفكك التسلسلي. بالنسبة لنوع الحالة الانتقالية، اختر 1 للدوران.
حدد G لقراءة ملفات برنامج النمذجة التي تحتوي على معلمات الدوران والاهتزاز PM6 لمجمع amb-metal بالإضافة إلى منتجات NTA. أدخل لا ل:هل أحد حالات انتقال حد مساحة الطور ، أو PSL TS ، الأنواع ذرية؟ أدخل موقع واسم الملف المعقد amb-metal.
استخدم 1.062 لترددات المقياس، واضغط على Enter لعدد الذرات، وأدخل لا ل:هل الجزيء خطي؟ كرر نفس الشيء لملف النمذجة الذي يحتوي على الترددات الاهتزازية والدورانية لمنتج NTA. أدخل وصف TS المدارية. أدخل 1.0 لشحن أيون معدن amb، ثم أدخل قابلية الاستقطاب وعزم ثنائي القطب ل NTA.
حدد 0 كلفن لدرجة الحرارة الدورانية وثنائي القطب المقفل لمعالجة الحالة الانتقالية المدارية. أدخل متوسط كتل أيون معدن amb و NTA. اضغط على Enter لقراءة الثوابت الدورانية 1-D و 2-D من ملفات النمذجة.
حدد 0 للدوارات المعيقة ، و 1 لتماثل الجزيء ، و 1 لانحطاط التفاعل. أدخل الخيار بدون تغييرات. بالنسبة لقناة المنتج 2، حدد 1 لحالة الانتقال المفردة، و0 لللا شيء للتفكك التسلسلي، و1 للدوران حول نوع الحالة الانتقالية.
حدد G للقراءة في ملفات النمذجة التي تحتوي على معلمات الدوران والاهتزاز PM6 لمجمع NTA-metal ومنتجات AMB. ثم أدخل وصف TS المدارية. أدخل 1.0 لشحن أيون مركب معدن NTA، وأدخل قابلية الاستقطاب وعزم ثنائي القطب ل amb. حدد 0 كلفن لدرجة حرارة الدوران وثنائي القطب المقفل لمعالجة الحالة الانتقالية المدارية.
أدخل متوسط كتل مجمع NTA المعدني ومنتجات AMB. اضغط على Enter لقراءة الثوابت الدورانية 1-D و 2-D من ملفات النمذجة. حدد 0 للدوارات المعيقة ، و 1 لتماثل الجزيء ، و 1 لانحطاط التفاعل.
ثم أدخل بدون تغييرات. للتعامل مع دورات 2-D غير النشطة، حدد الخيارات الافتراضية لتوزيع الزخم الزاوي الإحصائي ودمج توزيع P-E وG على J. استخدم القيمة الافتراضية 32 في عدد النقاط في التكامل.
بالنسبة إلى قائمة النموذج، حدد تحسين المعلمات لاحتواء البيانات، وأدخل الحد الأدنى للطاقة والحد الأقصى للطاقة لبدء وإنهاء ملاءمة البيانات، على التوالي. حدد 1 للانحرافات المعيارية التجريبية لنماذج الترجيح. استنادا إلى البيانات، حدد حدا أدنى مقبولا للانحراف المعياري يتراوح عادة من 0.01 إلى 0.001.
استخدم القيمة الافتراضية لحد التقارب E0 وحدد لا للاحتفاظ بأي معلمة بالقيمة الحالية و0.5 و2.0 إلكترون فولت للحدود الدنيا والعليا و2 لطريقة التقييم المشتقة. من قائمة التحسين، حدد بدء التحسين. سيقوم برنامج CRUNCH بتحسين نموذج TCID المحدد إلى البيانات التجريبية.
أخيرا ، في قائمة النموذج ، حدد delta-H و S at T للتقييم الكيميائي الحراري لقناتي التفكك. تظهر الصورة التمثيلية الهياكل الأولية للببتيدات المعدنية البديلة A و H. يسلط اللون الضوء على مواقع ربط المعادن المحتملة.
يظهر هنا الاعتماد على الطاقة لتشكيل أيونات منتج amb-metal و NTA-metal. يتم تضمين طاقة التصادم في مركز الكتلة ، حيث يوجد تفكك بنسبة 50٪ للمجمع الثلاثي amb-metal-NTA ، في الرسوم البيانية. تظهر الصور التمثيلية نموذج الديناميكيات لطريقة TCID التي تم حلها بالطاقة.
تؤدي التصادمات بين مركب ambH-zinc-NTA بالإضافة إلى الأرجون إلى الانفصال إلى مجمع ambH-zinc و NTA المجاني ، أو مجمع NTA-zinc ومنتجات ambH المجانية. تعادل طاقات العتبة E1 و E2 المحتوى الحراري 0 كلفن للتفكك لتفاعل مركب ambH-zinc-NTA إلى مركب ambH-zinc و NTA الحر ، أو مركب ambH-zinc-NTA إلى مركب NTA-الزنك و ambH الحر ، على التوالي. يتم عرض مجمعات AMB-metal-NTA الثلاثية المحسنة للهندسة PM6 من A و H هنا.
تم استخدام هذه المطابقات في نمذجة TCID للبيانات التجريبية وتم اختيارها من هياكل مرشحة أخرى من خلال مقارنة طاقاتها الإلكترونية PM6 وكيفية حساب مقاطع التصادم العرضية مقارنة بالمقاطع العرضية للتصادم التي قامت IM-MS بقياسها. يتم تصوير TCID الذي تم حله بالطاقة لمجمعات amb-metal-NTA الأربعة في هذه الصور. بالنسبة للنوعين A و H ، يتم عرض أيونات المنتج من amb-metal و NTA-metal مع تناسب عتبة CRUNCH المعقدة هنا.
قيم الطاقة هي المحتوى الحراري للتفكك عند 0 كلفن للتفاعلات amb-metal-NTA إلى amb-metal و NTA الحر ، أو amb-metaL-NTA إلى NTA-metal و amb الحر. تظهر هنا مقارنة بين طاقات جيبس الحرة للارتباط بالكيلوجول لكل مول وثوابت التكوين المشتقة من المحتوى الحراري للتفكك ، صافي الصفر كلفن ، مع حسابات الميكانيكا الإحصائية باستخدام معلمات PM6. يظهر تفاعل NTA-nickel و ambA الحر لتشكيل مركب ambA-nickel-NTA أعلى ثابت تكوين ويمثل التفاعل حيث يتم تجميد البروتين الموسوم ب ambA بواسطة NTA-nickel داخل عمود التقارب.
يتطلب تركيب CRUNCH فحصا دقيقا للمواد المتفاعلة والمنتجات للحصول على طاقات عتبة دقيقة. مطلوب خبرة في النمذجة الجزيئية للحصول على الهياكل والمعلمات الجزيئية الموثوقة. يمكن تطوير الطرق الشاملة الموصوفة هنا لفحص فعالية الجزيئات المصممة لربط العوامل المساعدة المعدنية والمواقع النشطة للبروتينات لمنع الوظائف الأنزيمية.
