Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería conceder # EB003307 y por el Premio Nacional de Ciencias de Carrera Fundación de AF

El diseño de dispositivos de microfluidos con CorelDraw o AutoCAD Principio de PDMS microválvulas dispositivos basados ​​en: Los dispositivos constan de tres capas: una capa de fluido que contiene microcámaras de diferentes tamaños, una &quot;capa de control&quot; que contiene los microcanales necesaria para accionar la vía de fluidos con microválvulas, y una membrana de PDMS media delgada que está obligado a la capa de control. En reposo, debido a la aceptación y la hidrofobicidad de PDMS, los sellos de membrana (reversible) en contra de su sede, por lo tanto, las cámaras permanecen aislados unos de otros sin el aporte de energía. Las válvulas se pueden abrir mediante la aplicación de presión negativa (por ejemplo, el vacío de la casa), por lo que la membrana de PDMS se desvía hacia abajo y se separa de la superficie que soporta la pared entre las dos cámaras de fluidos, lo que conecta el camino de fluidos. Cierre de la válvula se puede lograr cambiando el ajuste de presión de vacío a presión atmosférica. Capa de fluidos y los patrones de control de la capa fueron diseñados utilizando CorelDraw o AutoCAD. Máscaras que contienen estos diseños fueron impresas en alta resolución (8.000 a 20.000 dpi) en las películas de transparencia a través de servicios comerciales (CAD / Arte, Bandon, Oregón) (máscaras no se muestra). Fabricación de los maestros de silicio estándar con SU-8 fotolitografía <ol><li> Estándar de SU-8 métodos de fotolitografía se utiliza para crear SU-8 &quot;maestros&quot; (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) para la capa de microfluidos y la capa de control de la válvula en una sala limpia (no se muestra en este video). </li><li> Para facilitar la liberación, antes de la replicación PDMS el SU-8, los maestros se silanizada por la exposición a un vapor de un fluorosilane ((tridecafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (TFOCS)), en un jar desecador (sin secado pellets) conectado a una fuente de vacío. La cámara de desecador debe estar ubicado dentro de una campana extractora de humos químicos, debido a la naturaleza corrosiva de los vapores TFOCS. </li><li> Coloque una pequeña porción de toalla de papel absorbente en la cámara de desecador. Añadir una gota de TFOCS a la toalla de papel y evacuar el aire de la cámara. Aplicar vacío durante 1 minuto y se apagará. Cierre el vacío y dejar 30 minutos para la deposición. Mantenga a los maestros en contenedores cerrados para su uso futuro. </li></ol> Replica moldeo de PDMS de los maestros <ol><li> La capa de fluido y la capa de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestros. </li><li> Mezclando PDMS pre-polímero y la cruz enlazador (10:01 en peso. Ratio), de la burbuja en un desecador durante 10-15 minutos hasta que las burbujas claro. </li><li> Corte el tubo de silicona en las piezas 1.2 cm de largo. Elija el tamaño apropiado de la tubería de acuerdo con la aplicación. Usamos tubos de 1,14 mm de diámetro aquí para una fácil conexión a la tubería de diámetro exterior 1 / 16 pulgadas más tarde. </li><li> El uso de cemento Duco ® a un tubo de pegamento en las regiones de entrada de la SU-8 maestros de la capa de control. Tenga cuidado de no usar demasiado pegamento, ya que el tubo de silicona se hace de los mismos componentes que PDMS, y el tubo se integrará en el dispositivo de microfluidos PDMS, creando entradas de aire y fluidos apretado / puntos de venta. </li><li> En nuestro equipo, las regiones de entrada se han diseñado en las máscaras de los dos fluidos y las capas de control, pero las entradas de tubo de silicona sólo están moldeados en una sola capa (por ejemplo, la capa de control) del aparato. Para crear las entradas a la capa de fluido, que elimina manualmente o perfore las pocas secciones de la membrana que cubre las regiones de entrada. Por lo tanto, después de la alineación y el montaje, todos los microcanales (los que llevan el flujo, así como aquellos que controlan las válvulas) son accesibles desde la parte superior del dispositivo de manera que la superficie inferior es plana, lo que permite imágenes de dicho dispositivo en la platina del microscopio convencional. </li><li> Vierta cuidadosamente de-burbujas PDMS a ambos maestros, alrededor de la tubería en el control maestro de la capa. De la burbuja de nuevo en un desecador. Después de-burbujas es completa, puesto en 65 ° C para el horno&gt; 1 hora para el curado. </li><li> Quitar curado PDMS cubierto maestros del horno. </li><li> Cortar los dispositivos individuales de los maestros (cada maestro tiene tres dispositivos idénticos) y fuera de la cáscara. </li><li> Quitar pegamento de las regiones de entrada con una aguja o un par de pinzas. </li><li> Tome el control de la capa de PDMS en la sala limpia. </li></ol> Delgada membrana de PDMS de fabricación <ol><li> Como se muestra en el principio dispositivo, la capa intermedia es de un ~ 12 micras de espesor membrana de PDMS. </li><li> Mezcla 10:01 en peso. proporción de PDMS prepolímero / mezcla de agente de curado con hexano (3:1 en peso. ratio) por agitación. </li><li> Entrar en una habitación limpia. (Un ambiente libre de polvo es fundamental para garantizar que el PDMS están libres de defectos, partículas de polvo puede resultar en las membranas que contienen agujeros y / o defectuosa obligado al molde de réplica.) </li><li> Ponga un silanizada de 3 pulgadas de diámetro en la obleapara el plato vacío de una ruleta Solitec. La oblea tiene que ser silanizada (modificado con fluorosilane) antes de PDMS girar para facilitar la liberación de PDMS de la superficie de silicio. El recipiente de teflón fuera del plato estaba envuelta con film de plástico para facilitar su limpieza. </li><li> Prescindir de 2-3 ml de PDMS / hexano sobre la oblea con una aguja de la jeringa de 18 Gauge (para minimizar las burbujas). </li><li> Establezca los parámetros de giro. Giran a 7000 rpm durante 30 segundos, lo que resulta en una película de PDMS de espesor ~ m 12. </li><li> El calor de la oblea a 85 ° C durante 4 minutos en un plato caliente para curar la película de PDMS. </li></ol> Multicapa PDMS dispositivo de unión y montaje <ol><li> Poner la capa de control y la membrana de PDMS en una cámara de plasma de oxígeno. A su vez en el plasma durante 30 segundos (la presión de oxígeno de 30 psi, flujo 3.5 SCFH, 550W). Llevar el control de la capa en contacto con la membrana de PDMS inmediatamente (menos de 5 minutos) después de la activación de oxígeno. Los parámetros del sistema, tales como la presión de oxígeno, velocidad de flujo, y el poder de plasma y el tiempo de tratamiento, son empíricamente configurado de acuerdo a las diferentes aplicaciones. </li><li> Espere 5 minutos y retire la capa de control de la oblea, junto con la membrana. </li><li> Quitar las membranas de las áreas a fin de que las entradas de control y las capas de fluidos son accesibles desde la parte superior a través de la tubería. </li><li> Alinear a la capa de control (con tubos de entradas) con la capa de fluido (plano) en un estereoscopio. Debido a que los sellos en PDMS PDMS, no se requiere la unión permanente. </li></ol> Controlados por el ordenador de apertura y cierre de microválvulas PDMS por vacío o presión <ol><li> Después de la alineación y el montaje del dispositivo, inserte 1 / 16 pulgadas OD (1 / 32 de pulgada ID) en el tubo Tygon de 1,14 mm de silicona las entradas de ID y conectar las entradas a las fuentes de presión o los depósitos de fluidos. </li><li> Para la apertura y cierre de válvulas, las presiones están controladas por una línea de vacío y una línea de presión de aire conectado a través de dos reguladores de presión para una amplia gama de válvulas de solenoide en miniatura de tres vías. </li><li> Las válvulas de solenoide están conectados a Nacional de hardware de adquisición de instrumentos de datos controlados por el software LabVIEW. </li><li> La operación del dispositivo y la desviación de membrana se visualizan con un color CCD de la cámara (SPOT RT, instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI). </li></ol> Paralelo mezcla de dos colorantes de diferente color en diferentes volúmenes nanolitros definido Se demuestra la operación de un mezclador en paralelo que permite el almacenamiento y la mezcla precisa sub-nanolitros volúmenes de las soluciones acuosas en diferentes proporciones de mezcla: <ol><li> La capa de fluido contiene dos conjuntos de microcámaras: A lo largo de una variedad, el tamaño de las microcámaras disminuye, empezando por la izquierda, de 200 m x 400 m y 200 m x 40 m; A 10 es de 500 m x 40 m, y la cámara se utiliza sólo para la conexión de fluidos en el Array A, a la derecha de la cámara A 10 es un conjunto de cámaras de forma simétrica en aumento en los tamaños. Las cámaras de serie B están diseñados de tal manera que el volumen adicional de cualquiera de las dos cámaras adyacentes en diferentes filas siempre igual. A 0, A 10r 0r y 10 B, B están diseñados los controles respectivos de las soluciones A y B sin mezclarse. </li><li> La capa de control tiene dos controles independientes conjuntos de válvulas. Un conjunto de válvulas {1} V se utiliza para conectar dos conjuntos de cámara con sus respectivas entradas, mientras que un segundo grupo de válvulas {2} V se utiliza para conectar cada par de cámaras en las dos matrices. </li><li> Llene el primer set por microcámaras válvula V {1} para permitir el flujo de dos soluciones de tinte a las matrices A y B, respectivamente. Flujo de las soluciones se puede lograr ya sea a mano o por el vacío tirando controlados con válvulas de solenoide. Si las burbujas de aire se forman en el microcámaras, más solución puede ser empujado para eliminar las burbujas, o el dispositivo se puede dejar durante unos minutos y las burbujas desaparecerán debido a la permeabilidad al aire de PDMS. </li><li> Cerrar el conjunto de la válvula V {1} para aislar cada cámara en ambas matrices. </li><li> Conjunto de apertura de la válvula V {2} para permitir que el líquido de mezcla entre cámaras adyacentes en diferentes matrices. Mezcla sólo lleva alrededor de 1-2 minutos para completar para estos volúmenes. </li><li> Cerca {2} V para empujar el líquido de regreso a cada cámara de fluidos y las cámaras de deformar a su forma original. Puesto que los dos conjuntos de fluidos están diseñados con las cámaras de 11 tamaños diferentes, 11 diferentes proporciones de mezcla se producen en una etapa de mezcla única. </li></ol> Un sistema integrado de microfluidos para el equipo controlado por la perfusión de los cultivos celulares de microfluidos Demostramos un sistema de microfluidos que es capaz de la perfusión automatizado de múltiples soluciones a una cámara de cultivo de células individuales. Lalas entradas están controladas por microválvulas, que puede ser activado en cualquier secuencia de entradas individuales, combinaciones de varios, o todos a la vez. El dispositivo es capaz de producir gradientes o mezclas de las distintas soluciones. Este dispositivo también consta de tres capas: una capa de fluido, una capa de control, y una delgada membrana media PDMS. Medidas alternativas de fabricación de este dispositivo: <ol><li> Los puertos de entrada para los canales fluidos y canales de control son &quot;un puñetazo&quot;, con un 1,2 mm de diámetro Harris Micro-Punch (Ted Pella, Inc.). Tubo se conecta a las entradas mediante el uso de agujas de calibre 18 embotado que se insertan en el PDMS a través de la capa de control. Esto permite un empaquetamiento más denso de entradas que el tubo de silicona. El cumplimiento de la PDMS proporciona un sello hermético alrededor de las agujas para cumplir efectivamente con el líquido o la presión de neumáticos. </li><li> Como se describió anteriormente, la unión de la delgada membrana de PDMS para la capa de control se realiza mediante la exposición al plasma de oxígeno. </li><li> La capa de fluido se prepara por moldeo réplica con PDMS pre-polímero y la cruz enlazador-en una proporción de 5:1 y en parte curado durante 25 minutos a 60 ° C en un horno de convección. En este punto, la capa de fluido parcialmente curado todavía está pegajosa, sin embargo, puede ser removido de la maestra. </li><li> La capa de fluido se alinean de forma manual para el control pre-ensamblados y capas de la membrana con un estereoscopio. El dispositivo montado se coloca sobre una placa durante 5 minutos a 80 º C. A continuación, las líneas de válvulas de control están conectados al controlador automático y las válvulas se accionan hasta que la membrana se separa de la capa de fluido en todos los asientos de las válvulas mediante la aplicación de vacío. Después de &quot;desconectar&quot; de las válvulas, el controlador de equipo está configurado para el ciclo de las válvulas de encendido y apagado mientras el dispositivo está más curado en la zona de cocción a 80 º C durante al menos 1 hora. </li></ol> Las características de nuestro sistema integrado de microfluidos: El dispositivo es capaz de perfusión automatizado de 16 soluciones diferentes a una cámara de cultivo celular utilizando un esquema de válvulas de multiplexado. El diseño del canal se asegura de que la resistencia de todas las entradas está equilibrado. Nuestro diseño microválvula aislados de las soluciones y los controles de lavado a través de canales integrados para la rápida eliminación de líquido, lo que limita la contaminación cruzada. Un mezclador de espiga integrada se puede activar para producir mezclas de diferentes entradas. Además, hay cuatro diferentes canales de la resistencia que puede ser activada para alterar la velocidad de flujo.

<ol>
	<li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays.">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li></ol>

Las principales ventajas de nuestro diseño microválvula: <ol><li> Ninguna fuente de energía adicional es necesaria para cerrar el trazado fluido, por lo tanto, el dispositivo de carga es muy portátil, y </li><li> El dispositivo puede ser construido por réplicas de PDMS photolithographically con estampado de SU-8 moldes, lo que permite microfabricating profundas (hasta 1 mm) de canales con paredes laterales verticales (es decir, la altura de las características se puede especificar independientemente de su anchura) y que resulta en...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Clean silicon wafers</td>
<td>Supplies</td>
<td>Silicon Sense Inc.</td>
<td>3P0110TEST</td>
<td>3-inch diameter, P/Boron</td>
</tr>
<tr>
<td>"Master" wafers containing SU-8 patterns</td>
<td>Supplies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fabricated in house using standard photolithography procedures </td>
</tr>
<tr>
<td>Desiccators (2)</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>24987-048</td>
<td>One for silanization, one for PDMS de-bubbling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>OHAUS Corp.</td>
<td>SC6010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sheldon Mfg. Inc.</td>
<td>1330GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MiniVortexer</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>58816-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Headway Research Inc.</td>
<td>PWM32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma etcher</td>
<td>Equipment</td>
<td>Plasmatic Systems Inc. </td>
<td>Plasma Preen II-973</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Plate</td>
<td>Equipment</td>
<td>Torre Pines Scientific</td>
<td>HP30A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>Equipment</td>
<td>Diagnostic Instruments</td>
<td>SPOT RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solenoid valves</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lee Company</td>
<td>LHDA0511111H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Data acquisition board</td>
<td>Hardware</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6025E, CB-50LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabView</td>
<td>Software</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
<td>Reagent</td>
<td>United Chemical Technologies</td>
<td>T2492</td>
<td>Silanization must be done in a chemical fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS prepolymer and crosslinker</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow-Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hexane</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD	</td>
<td>HX0295-6	</td>
<td>

</td>
</tr>
<tr>
<td>Color Dyes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td>
<td>FD&C 110, 135, 150</td>
<td>Blue #1, Yellow #5, Red #3. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml disposable transfer pipets</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Weighing boats</td>
<td>Supplies</td>
<td>VWR </td>
<td>12577-027</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Tongue depressor</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Fisher Scientific	</td>
<td>11-700-555	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P100 dishes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-772E</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.</td>
<td>07625-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.	</td>
<td>06418-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duco Cement</td>
<td>Supplies</td>
<td>Devcon</td>
<td>6245</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>Tools</td>
<td>VWR</td>
<td>55411-050</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0053482 (25 Gauge)</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>#5 Forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-526B</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Seal wrap film</td>
<td>Supplies	</td>
<td>AEP Industries Inc.	</td>
<td>0153877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-406-16</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes	</td>
<td>Supplies	</td>
<td>BD Falcon	</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purple nitrile power-free gloves</td>
<td>Supplies 	</td>
<td>VWR 	</td>
<td>40101-348</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.2 mm Harris biopsy punch	</td>
<td>Tools</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>15074	</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays

Miniaturizados sistemas de microfluidos ofrecer soluciones sencillas y eficaces de bajo costo en el punto de atención de diagnóstico y de alto rendimiento ensayos biomédicos. Control de flujo robusto y preciso volúmenes de fluidos son dos requisitos fundamentales para estas aplicaciones. Hemos desarrollado los chips de microfluidos con elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) arrays microválvula que: 1) necesidad de ninguna fuente de energía adicional para cerrar el trazado fluido, por lo tanto, el dispositivo de carga es muy portátil, y 2) permitir microfabricating profundas (hasta 1 mm) canales con paredes laterales verticales y dando lugar a unas características muy precisas. El PDMS microválvulas basada en dispositivos constan de tres capas: una capa de fluido que contiene las rutas de fluidos y microcámaras de diferentes tamaños, una capa de control que contiene los microcanales necesaria para accionar la vía de fluidos con microválvulas, y una membrana de PDMS media delgada que está enlazado con el control capa. Capa de fluidos y capas de control son realizadas por moldeo réplica de PDMS de SU-8 maestros fotosensible, y la delgada membrana de PDMS se hace al girar PDMS en altura especificada. La capa de control se une a la delgada membrana de PDMS después de la activación de oxígeno de ambos, y luego se ensamblan con la capa de fluido. El microválvulas están cerrados en reposo y se puede abrir mediante la aplicación de presión negativa (por ejemplo, el vacío de la casa). Microválvula cierre y la apertura son automatizados a través de las válvulas de solenoide controlado por programas informáticos. Este sentido, demuestran dos microválvula basada en los chips de microfluidos para dos aplicaciones diferentes. El primer chip permite almacenar y mezcla precisa sub-nanolitros volúmenes de las soluciones acuosas en diferentes proporciones de mezcla. El segundo chip permite controlados por el ordenador de perfusión de los cultivos celulares de microfluidos. Los dispositivos son fáciles de fabricar y sencillo de controlar. Debido a la biocompatibilidad de PDMS, estos microchips podría tener amplias aplicaciones en miniatura ensayos de diagnóstico, así como estudios básicos de biología celular.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Nos demuestran los protocolos de fabricación y automatización de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) basado en matrices microválvula que no necesitan energía extra para cerrar y cuentan con photolithographically define volúmenes precisos. Un paralelo subnanoliter volumen de mezclador y un sistema integrado de perfusión de microfluidos se presentan.

Los chips de microfluidos controlado con matrices elastoméricas microválvula

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K vistas.  University of Washington. Nos demuestran los protocolos de fabricación y automatización de elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) basado en matrices microválvula que no necesitan energía extra para cerrar y cuentan con photolithographically define volúmenes precisos. Un paralelo subnanoliter volumen de mezclador y un sistema integrado de perfusión de microfluidos se presentan.

Video: Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Investigación

Biología

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

Fabricación de los canales de microfluidos termoplástico

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

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Las solicitudes de microfluidos para el diagnóstico desechables

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Diseño y uso de arrays de quimiostato multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Asamblea de Nucleosomal Arrays de recombinantes Core histonas y el ADN posicionamiento de nucleosomas

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...