Nosso protocolo descreve um método de microfresagem de alta resolução para fabricar um dispositivo microfluídico acrílico para imunodetecção quantitativa de concentrações de analitos comparáveis à técnica ELISA padrão-ouro. O destaque é a fabricação de um dispositivo microfluídico termoplástico simples e de baixo custo, sem sala limpa, o que permite tempos de ensaio mais curtos e bons limites de detecção de forma quantitativa. Comece pela moagem da superfície.
Corte retângulos de 9 x 25 milímetros de PMMA de 1,3 milímetro de espessura com o bit final do moinho de 800 micrômetros. Anexe um desses retângulos cuidadosamente com fita adesiva de dupla face à plataforma piezoelétrica. Conecte e coloque o sensor Z na superfície do retângulo PMMA.
Selecione o pino de detecção e mova-o sobre a superfície do sensor. Abaixe o pino manualmente sem entrar em contato com o sensor. Ative o modo de detecção Z-zero.
Gire o bit final do moinho de 200 micrômetros a 14, 500 rpm. Abaixe lentamente até a coordenada de origem no eixo z. Em seguida, redefina o eixo z 30 micrômetros abaixo da origem.
Defina essa coordenada como a nova origem Z. Clique no botão Cortar no software da máquina de microfresagem para ativar o painel de corte. Clique no botão Adicionar e selecione o arquivo TXT com um código previamente criado para a moagem da superfície acrílica.
Clique no botão Saída para iniciar o processo. Para fresamento da restrição de cinco micrômetros, primeiro, defina a velocidade de rotação do bit do moinho final para 11.000 rpm. Em seguida, eleve a plataforma em 6,5 micrômetros com a interface da plataforma piezoelétrica.
Mova o bit do moinho final ao longo do eixo y em 500 micrômetros. Retorne a plataforma piezoelétrica ao seu valor inicial no eixo z com a interface de controle. Em seguida, execute a fresagem de microcanais abrindo o arquivo de projeto criado anteriormente a partir do software de design.
Clique no botão Imprimir, acesse o menu de propriedades e clique na janela de cores correspondente à camada que contém o desenho a ser usinado. Defina os parâmetros de fabricação no painel de ferramentas. Para fresamento de furos, mude para o bit final do moinho de 800 micrômetros.
Ative a camada de design dos orifícios de 1,2 milímetro de diâmetro clicando na janela de cores correspondente e selecionando os parâmetros de fabricação correspondentes. Máquina dois furos adicionais em cantos contralaterais do retângulo para o alinhamento do acrílico de forma invertida em uma nova plataforma. Vire o acrílico e cole-o com fita adesiva de dupla face sobre o adaptador com os pilares usinados.
Abra o arquivo com o design dos orifícios para a face oposta do software de design. Moer a metade restante dos orifícios de entrada e saída do reagente com um diâmetro de 1,5 milímetros e uma profundidade de 0,7 milímetros. Limpe ambas as folhas de retângulo acrílico com álcool isopropílico e enxágue com água destilada.
Mergulhe o acrílico em um banho ultra-sônico por 10 minutos. Seque ambas as folhas de acrílico e cole-as no interior de uma tampa de placa de Petri de vidro com fita adesiva de dupla face. Em seguida, coloque a base da placa de Petri de vidro dentro de uma placa de Petri de vidro maior.
Despeje um mililitro de clorofórmio na base da placa de Petri e coloque rapidamente a tampa com as folhas de acrílico. Adicione imediatamente água destilada à base da placa de Petri maior até o nível da tampa da placa de Petri. Permitir a exposição do acrílico ao gás clorofórmio por um minuto.
Em seguida, incline a placa de Petri para quebrar o selo de água e descubra imediatamente a placa de Petri. Para a colagem, alinhe ambos os acrílicos com o clorofórmio exposto lado a lado e forme um sanduíche. Coloque os acrílicos na prensa por dois intervalos de dois minutos, alterando o alinhamento do acrílico.
Em seguida, prenda dois a três centímetros de mangueira a cada um dos orifícios do dispositivo com adesivo líquido de secagem instantânea. Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Mergulhe o dispositivo em um banho ultra-sônico por 10 minutos.
Em seguida, esvazie a água dentro dos canais do dispositivo e use uma seringa para introduzir a solução de BSA a 5%. Preparar uma suspensão de micropartículas de ferro de diâmetro a 7,5 micrômetros em BSA a 5%. Incubar o chip e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio durante, pelo menos, uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral. Coloque o chip verticalmente e, em seguida, gire o chip em duas etapas de 90 graus, de modo que as micropartículas sejam direcionadas e compactadas na restrição de cinco micrômetros. Sele todas as mangueiras do dispositivo acrílico com calor.
Corte a mangueira de entrada até que restem apenas alguns milímetros. Encha a agulha de dosagem com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar e, em seguida, conecte a agulha ao dispositivo.
Corte a mangueira de saída do canal lateral e, em seguida, ligue à bomba da seringa. Em seguida, repita o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal. Em seguida, conecte o chip ao ímã.
Para imunodetecção, mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 minutos a 50 microlitros por hora. Remova o tampão de lavagem restante da agulha de dosagem com uma micropipeta e adicione 50 microlitros da suspensão de nanopartículas. Fluidar a suspensão de nanopartículas durante sete minutos a um caudal de 100 microlitros por hora.
Em seguida, altere a taxa de fluxo para 50 microlitros por hora e continue o fluxo por mais 15 minutos. Troque a agulha de dosagem e flua o tampão de lavagem por 10 minutos na mesma taxa. Remova o tampão de lavagem restante da agulha de dosagem com uma micropipeta e adicione 100 microlitros do substrato fluorogênico.
Ajuste a taxa de fluxo e os parâmetros de tempo para entrada de substrato, medição de fluorescência e etapa de lavagem. Ativar o fluxo de entrada do substrato fluorogênico por seis minutos a 50 microlitros por hora. 15 segundos antes de o fluxo do substrato parar, ligue a fluorescência do microscópio.
Inicie a captura de imagem com o software da câmera do microscópio 10 segundos antes de o substrato parar com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos. Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a parada da lavagem do substrato. Realize imagens por seis minutos a um quadro por segundo.
Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem imediatamente após a parada do fluxo de medição selecionado. Nanopartículas conjugadas de lisozima e anticorpo secundário conjugado de rabanete de rábano foram utilizados para o imunoensaio. Um aumento na intensidade de fluorescência para diferentes concentrações de anticorpos primários foi observado comparando regiões antes e após a armadilha, mostrando que a mudança na fluorescência do substrato é diretamente proporcional à concentração de anticorpo primário.
Para uma dada concentração de anticorpo primário, a intensidade de fluorescência foi plotada em função do tempo em diferentes taxas de fluxo do substrato fluorogênico. A capacidade de conversão do substrato pela enzima HRP foi inversamente proporcional à vazão, obtendo-se uma intensidade máxima para uma vazão de um microlitro por hora. Para as diferentes taxas de fluxo para várias concentrações de anticorpos primários, as curvas das diferenças de fluorescência após e antes da imunorreação mostraram que, para uma concentração de 1.000 nanogramas por mililitro, a fluorescência satura para todas as taxas de fluxo avaliadas.
Uma curva de calibração foi elaborada utilizando o valor máximo das diferenças na intensidade de fluorescência obtidas em relação à concentração de anticorpos primários para cada vazão. A alta variabilidade e os altos níveis de fluorescência a um microlitro por hora sugeriram que a taxa não favorece o fluxo do substrato reagente e tende a se acumular logo após a armadilha. Atenção especial deve ser dada às etapas de vedação dos microcanais, uma vez que a exposição ao clorofórmio é muito sensível à temperatura.
Para resultados reprodutíveis, a temperatura deve ser sempre a mesma. Nosso sistema ajuda a entender onde a compacidade e o tamanho das micropartículas, o tamanho das nanopartículas, os antígenos, o anticorpo de detecção e o substrato são fatores determinantes para o limite da detecção no imunoensaio microfluídico à base de nanopartículas.
