Il nostro protocollo descrive un metodo di microfresatura ad alta risoluzione per fabbricare un dispositivo microfluidico acrilico per la rilevazione quantitativa di concentrazioni di analiti paragonabile alla tecnica ELISA gold standard. Il clou è la fabbricazione di un dispositivo microfluidico termoplastico semplice e a basso costo senza camera bianca, che consente tempi di analisi più brevi e buoni limiti di rilevamento in modo quantitativo. Inizia con la rettifica superficiale.
Tagliare rettangoli 9 x 25 millimetri di PMMA di spessore 1,3 millimetri con la punta da 800 micrometri. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con nastro biadesivo alla piattaforma piezoelettrica. Collegare e posizionare il sensore Z sulla superficie del rettangolo PMMA.
Selezionare il perno di rilevamento e spostarlo sulla superficie del sensore. Abbassare manualmente il perno senza contattare il sensore. Attivare la modalità di rilevamento Z-zero.
Ruotare la punta della fresa da 200 micrometri a 14.500 giri / min. Abbassatelo lentamente fino alla coordinata di origine sull'asse z. Quindi reimpostare l'asse z 30 micrometri sotto l'origine.
Impostate questa coordinata come nuova origine Z. Fare clic sul pulsante Taglia nel software della microfresatrice per attivare il pannello di taglio. Fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare il file TXT con un codice creato in precedenza per la levigatura della superficie acrilica.
Fare clic sul pulsante Output per avviare il processo. Per la fresatura della restrizione di cinque micrometri, in primo luogo, impostare la velocità di rotazione della punta della fresa a 11.000 giri / min. Quindi, sollevare la piattaforma di 6,5 micrometri con l'interfaccia della piattaforma piezoelettrica.
Spostate la punta della fresa lungo l'asse y di 500 micrometri. Riportare la piattaforma piezoelettrica al suo valore iniziale sull'asse z con l'interfaccia di controllo. Quindi, eseguire la fresatura dei microcanali aprendo il file di progettazione creato in precedenza dal software di progettazione.
Fare clic sul pulsante Stampa, accedere al menu delle proprietà e fare clic sulla finestra dei colori corrispondente al livello contenente il disegno da lavorare. Impostate i parametri di fabbricazione nel pannello degli strumenti. Per la fresatura dei fori, passare alla punta da 800 micrometri.
Attivate il livello di progettazione dei fori di 1,2 millimetri di diametro facendo clic sulla finestra di colore corrispondente e selezionando i parametri di fabbricazione corrispondenti. Lavorare due fori aggiuntivi sugli angoli controlaterali del rettangolo per l'allineamento dell'acrilico in modo invertito su una nuova piattaforma. Capovolgere l'acrilico e fissarlo con nastro biadesivo sopra l'adattatore con i pilastri lavorati.
Aprire il file con il design dei fori per la faccia opposta rispetto al software di progettazione. Fresare la metà rimanente dei fori di ingresso e uscita del reagente con un diametro di 1,5 millimetri e una profondità di 0,7 millimetri. Pulire entrambi i fogli rettangolari acrilici con alcool isopropilico e risciacquare con acqua distillata.
Immergere l'acrilico in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti. Asciugare entrambi i fogli acrilici e fissarli all'interno di un coperchio di piastra di Petri di vetro con nastro biadesivo. Quindi posizionare la base della capsula di Petri di vetro all'interno di una capsula di Petri di vetro più grande.
Versare un millilitro di cloroformio nella base della piastra di Petri e posizionare rapidamente il coperchio con i fogli acrilici. Aggiungere immediatamente acqua distillata alla base della capsula di Petri più grande fino al livello del coperchio della capsula di Petri. Consentire l'esposizione dell'acrilico al gas cloroformio per un minuto.
Quindi inclinare la capsula di Petri per rompere il sigillo dell'acqua e scoprire immediatamente la capsula di Petri. Per l'incollaggio, allineare entrambi gli acrilici con i lati esposti al cloroformio faccia a faccia e formare un sandwich. Posizionare gli acrilici nella pressa per due intervalli di due minuti, cambiando l'allineamento dell'acrilico.
Quindi attaccare due o tre centimetri di tubo a ciascuno dei fori del dispositivo con adesivo liquido ad asciugatura istantanea. Riempire i canali con acqua distillata usando una siringa. Immergere il dispositivo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti.
Quindi svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo e utilizzare una siringa per introdurre la soluzione al 5% di BSA. Preparare una sospensione di microparticelle di ferro di diametro a 7,5 micrometri in 5% BSA. Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, inserire le microparticelle nel chip con un ago della siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale. Posizionare il chip verticalmente, quindi ruotare il chip in due passaggi di 90 gradi in modo che le microparticelle bersaglino e si compattano alla restrizione di cinque micrometri. Sigillare tutti i tubi del dispositivo acrilico con calore.
Tagliare il tubo di ingresso fino a quando non rimangono solo pochi millimetri. Riempire l'ago di erogazione con tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo tagliato. Lasciare gocciolare la soluzione e quindi collegare l'ago al dispositivo.
Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale, quindi collegarlo alla pompa della siringa. Quindi, ripetere la stessa procedura per il tubo di uscita del canale principale. Quindi collegare il chip al magnete.
Per il rilevamento immunologico, mantenere il tampone di lavaggio in funzione per 10 minuti a 50 microlitri all'ora. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 50 microlitri della sospensione di nanoparticelle. Far scorrere la sospensione di nanoparticelle per sette minuti ad una portata di 100 microlitri all'ora.
Quindi cambiare la portata a 50 microlitri all'ora e continuare il flusso per altri 15 minuti. Cambiare l'ago erogatore e far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti alla stessa velocità. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago di erogazione con una micropipetta e aggiungere 100 microlitri di substrato fluorogenico.
Regolare i parametri di portata e tempo per l'ingresso del substrato, la misurazione della fluorescenza e la fase di lavaggio. Attivare il flusso di ingresso del substrato fluorogenico per sei minuti a 50 microlitri all'ora. 15 secondi prima che il flusso del substrato si arresti, accendere la fluorescenza del microscopio.
Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 secondi prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi. Fare clic sul pulsante Start del parametro della portata desiderata immediatamente dopo l'interruzione del lavaggio del substrato. Eseguire l'imaging per sei minuti a un fotogramma al secondo.
Fare clic sul pulsante Start del flusso di lavaggio immediatamente dopo l'arresto del flusso di misurazione selezionato. Per il test immunologico sono state utilizzate nanoparticelle coniugate con lisozima e anticorpi secondari coniugati con ravanello di rafano. È stato osservato un aumento dell'intensità della fluorescenza per diverse concentrazioni di anticorpi primari confrontando le regioni prima e dopo la trappola, dimostrando che la variazione della fluorescenza del substrato è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'anticorpo primario.
Per una data concentrazione di anticorpi primari, l'intensità della fluorescenza è stata tracciata in funzione del tempo a diverse portate del substrato fluorogenico. La capacità di conversione del substrato da parte dell'enzima HRP era inversamente proporzionale alla portata, è stata ottenuta un'intensità massima per una portata di un microlitro all'ora. Per le diverse portate per varie concentrazioni di anticorpi primari, le curve delle differenze di fluorescenza dopo e prima dell'immunoreazione hanno mostrato che per una concentrazione di 1.000 nanogrammi per millilitro, la fluorescenza satura per tutte le portate valutate.
È stata preparata una curva di taratura utilizzando il valore massimo delle differenze di intensità di fluorescenza ottenute rispetto alla concentrazione di anticorpi primari per ciascuna portata. L'elevata variabilità e gli alti livelli di fluorescenza a un microlitro all'ora hanno suggerito che la velocità non favorisce il flusso del substrato reagente e tende ad accumularsi subito dopo la trappola. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata alle fasi di sigillatura dei microcanali poiché l'esposizione al cloroformio è molto sensibile alla temperatura.
Per risultati riproducibili, la temperatura deve essere sempre la stessa. Il nostro sistema aiuta a capire dove la compattezza e la dimensione delle microparticelle, la dimensione delle nanoparticelle, gli antigeni, gli anticorpi di rilevamento e il substrato sono fattori determinanti per il limite di rilevazione nel saggio immunologico microfluidico basato su nanoparticelle.
