Este método ayuda a comprender cómo cambian las tasas de secreción con el tiempo y cómo las células responden a las señales sólidas variables en el tiempo. Las principales ventajas de esta técnica son que su bajo costo, requiere poca capacitación y la configuración del sistema de profusión se puede adaptar para experimentos novedosos. Comience llenando una jeringa con una solución de fondo y cárguela en la primera bomba de jeringa.
Llene otra jeringa con solución trazadora y cárguela en la segunda bomba de jeringa. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías utilizando conectores luer. Cierre la llave de paso a la solución de fondo y bombee la solución trazadora en la llave de paso hasta que gotee por el puerto abierto.
Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa. Asegúrese de que la barra móvil de las bombas de jeringa se empuje hacia arriba contra los émbolos de la jeringa para que el flujo comience inmediatamente cuando se inicie la bomba. Cierre la llave de paso a la solución trazadora y bombee la solución de fondo a la llave de paso hasta que toda la solución trazadora residual se haya eliminado del puerto abierto.
Detenga la bomba y no ajuste más la jeringa. Configure el componente del sistema de flujo deseado para el análisis RTD. Inserte el extremo en un dispensador de punta de pipeta y bombee la solución de fondo a través del componente hasta que esté completamente lleno.
Ajuste la bomba para la solución trazadora al caudal deseado. Cierre la llave de paso a la solución de fondo e inicie el flujo de la solución trazadora. Al mismo tiempo, inicie el colector de fracciones.
Continúe el flujo de la solución del trazador durante un corto período de tiempo para aproximarse a una entrada de impulso del trazador. Se recomienda una duración del pulso de 10 minutos para los RTD a un caudal de un mililitro por hora. Detenga la bomba de solución trazadora al final del período de pulso de la solución trazadora.
Cierre rápidamente la llave de paso a la solución trazadora e inicie el flujo de la solución de fondo al mismo caudal. Permita que la solución de fondo fluya y recolecte fracciones hasta que todo el trazador haya pasado a través del sistema y hacia las fracciones recolectadas. En condiciones estériles, inserte los tapones con agujas en los cultivos de la placa del pozo con las agujas levantadas.
Después de que el tapón esté en su lugar, baje las agujas a la altura deseada para la perfusión, ya que la altura de la aguja de salida determina el nivel estable de líquido. Tapa las agujas con tapas de luer macho y mantén toda la placa del pozo en una incubadora a 37 grados centígrados hasta su uso. Preparar los dos medios a utilizar para la perfusión, etiquetando el medio que se dispensará primero como uno y el otro medio dos.
Para cada cultivo a perfundir, llene una jeringa con una mediana para que dure toda la duración de su dispensación más el volumen suficiente para llenar inicialmente el sistema de perfusión. Llene una segunda jeringa con dos medios para que dure toda la duración de su dispensación. Conecte ambas jeringas a dos de los tres puertos de una llave de paso de cuatro vías.
Es posible que se requiera una longitud de tubo para conectar las jeringas a las llaves de paso. Prepare las llaves de paso cerrando la llave de paso para el medio uno y dispensando el medio dos en la llave de paso hasta que comience a gotear por el puerto abierto. A continuación, cierre la llave de paso para el medio dos y dispense el medio uno en la llave de paso hasta que todo el medio residual dos haya sido expulsado del puerto abierto.
Conecte el tubo aguas arriba al puerto de llave de paso abierto utilizando un conector hembra a barb luer. Inserte un conector macho a barb luer en el otro extremo del tubo. Dispense el medio uno de la jeringa hasta que el tubo aguas arriba se llene con medio y proceda con la preparación del tubo aguas abajo como se demostró anteriormente.
Inserte un conector macho a barb luer en un extremo del tubo aguas abajo y cúbralo con una tapa luer hembra. Lleve cuidadosamente todos los tubos preparados, jeringas y la placa del pozo a la incubadora que se utilizará para la perfusión. Coloque la bomba de jeringa y el colector de fracción en los lugares deseados cerca de la incubadora.
Coloque la bomba de jeringa encima o cerca de la incubadora y coloque el colector de fracción junto a la incubadora cerca del puerto. Cargue las jeringas en la bomba. Agrupe los extremos tapados de todos los tubos aguas arriba y aguas abajo y empuje desde el exterior de la incubadora hacia el interior a través del puerto.
Inserte los extremos abiertos de los tubos aguas abajo en las puntas de la pipeta dispensadora del dispensador multicabezal del colector de fracciones. Dentro de la incubadora, tire de la mayor cantidad posible de holgura de los tubos aguas arriba en la incubadora para maximizar la longitud del tubo a través del cual el medio que fluye puede recibir calor y dióxido de carbono. Para cada pozo enchufado, destape rápidamente las agujas y los tubos aguas arriba y aguas abajo para ese pozo, luego conéctelos junto con sus conectores luer.
Una vez que todas las piezas estén conectadas, haga funcionar brevemente la bomba de la jeringa a una velocidad relativamente alta para asegurarse de que todas las corrientes fluyan correctamente. En este punto, si se desea comenzar el experimento con los tubos aguas abajo llenos del medio, continúe haciendo funcionar la bomba hasta que todas estén llenas, de lo contrario, detenga la bomba. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa para el medio uno y la frecuencia de recolección de fracciones y arranque ambas máquinas simultáneamente para comenzar el experimento.
Cuando sea necesario cambiar la fuente del medio, detenga rápidamente la bomba de la jeringa por una mediana. Gire la llave de paso cerrada a la mediana uno y arranque la bomba de la jeringa para el medio dos. Si lo desea más tarde, vuelva a cambiar la fuente a la mediana de manera similar.
Recolectar fracciones para la duración deseada del experimento. Las concentraciones de trazadores en las fracciones de dos experimentos de IDT se midieron y se introdujeron en la IDT a partir de datos del script MATLAB para producir los dos RTD. Los tubos individuales y las múltiples piezas de tubos en serie encajan bien con un solo modelo de dispersión axial y la adición de una placa perfundida de 48 pocillos en línea causó una desviación insignificante que permitió que tanto el RTD de tubo de un metro como el RTD de todo el sistema se ajustaran mediante funciones de dispersión axial.
Se demostró un ejemplo de un ajuste deficiente del modelo utilizando el modelo de dispersión axial ajustado a los datos de RTD de un metro de tubo y se trazó junto con los datos. Las conjeturas iniciales de los parámetros se cambiaron para producir un buen ajuste del modelo donde tau era aproximadamente igual al volumen del sistema de perfusión dividido por su caudal volumétrico. Un pulso de 90 minutos de TNF-alfa se definió como la señal de entrada al sistema y se conplicó con el RTD de tubo de un metro para determinar la señal TNF-alfa en la entrada de la placa del pozo.
La señal de entrada también se conplicó con el RTD de todo el sistema para determinar la señal TNF-alfa a la salida del sistema en las fracciones recogidas. Las células HEK 293 fueron diseñadas para secretar GLuc impulsado por un promotor que contiene el elemento de respuesta NF-kappaB. El experimento reveló un aumento significativo de la expresión y una disminución lenta en la expresión de GLuc impulsada por NF-kappaB después de la exposición a TNF-alfa.
Las variaciones del sistema se describen en el documento adjunto, incluida una configuración más simple para experimentos que no requieren ingresar señales y exponer las células a perfiles de solutos conectivos pharma-hu.
