Los autores desean agradecer a Joe Owen en el Instrumento Biomédica y Machine Shop por sus incansables esfuerzos en la fabricación y montaje de las piezas de cámara de flujo y Matt Maudsley de Leica Microsystems para asistir en las técnicas de imagen a las células a través de cámaras de flujo. Estamos en deuda con Kevin Collins Servicios de perfusión de Duke y el Dr. Steve Wallace en el Departamento de Ingeniería Biomédica por sus útiles sugerencias sobre el diseño de flujo de circuito. También nos gustaría agradecer a la Fundación Nacional de Ciencias de Posgrado Programa de Becas de Investigación para el apoyo a Alexandra Jantzen y el NIH, por su apoyo a través de subvención &quot;forro autólogo de EPC para mejorar la biocompatibilidad de los dispositivos de asistencia circulatoria&quot; RC1HL099863-01.

<ol>
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La producción y el libre acceso de este video-artículo es patrocinado por Cole-Parmer Instrument Co.

Nuestro circuito de flujo y la cámara de flujo permiten someter a las células adherentes, EPC, por ejemplo, para definir destaca fluido de corte. Desde la cima de la cámara y el fondo son la adhesión transparente, y la morfología de células pueden ser evaluados, ya sea en tiempo real, a través de la propia cámara, o después de un experimento de flujo y el desmontaje de la cámara de flujo. En ese momento, las células pueden ser cosechadas en condiciones estériles y sea resembrado, o para recoger su ADN o ARN, etc, para su posterior análisis. Para conseguir un flujo laminar, el diseño de la cámara debe ser tal que se cumplen varias condiciones. En primer lugar, el flujo debe ser laminar, que se puede verificar mediante el cálculo de su número de Reynolds (Re), que es la relación de fuerzas de inercia a las fuerzas viscosas. (Si predominan las fuerzas viscosas, Re es pequeño y el flujo es laminar o &quot;plenamente desarrollado&quot; - por lo general para Re &lt;2300.Si predominan las fuerzas de inercia, el flujo se vuelve más y más al azar hasta que es turbulento, como es el caso de Re&gt; 4000). Podemos calcular Re acuerdo con la ecuación 3 8, <img alt="La ecuación 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Donde ρ es la densidad del fluido, Q es el caudal, μ es la viscosidad, w y h son la anchura y la altura de la cámara, respectivamente, y D h es el diámetro hidráulico, definido de acuerdo con la ecuación 4 8 <img alt="La ecuación 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> El número de Reynolds de nuestras cámaras de flujo de tres, con alturas que van desde 166 hasta 267 micras, rango de 13,9 a 34,6 en las tasas de flujo calculated para obtener una tensión de corte de 15 dinas / cm 2. En los caudales calculados para una tensión de corte de 100 dinas / cm 2, el número de Reynolds de las cámaras van desde 90,4 hasta 234. Todos estos números de Reynolds es mucho menor que 2300 y cumplen el criterio de flujo laminar. En segundo lugar, para el campo de la velocidad y la tensión de corte para ser independiente de la distancia a lo largo del canal de flujo (es decir, completamente desarrollado), la distancia desde la entrada de fluido a la diapositiva debe ser más largo que la longitud de entrada, e L. Esto puede ser satisfecho mediante el cálculo de la longitud de entrada, de acuerdo con la ecuación 5 9. <img alt="La ecuación 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Para los valores mencionados anteriormente, la longitud de entrada varía de 0,01 a 0,25 cm. En tercer lugar, con el fin de garantizar que la velocidad y el esfuerzo cortante en la dirección lateral no varíansignificativamente del valor de caudal en canal unidimensional (Ph Δ / 2 l), la relación h / w debe ser mucho menor que 1. Para la tensión de cizallamiento promedio bajo condiciones de flujo en dos dimensiones que el 95% de la tensión de cizallamiento en flujo unidimensional, h / w debe ser igual a 0,10, y para la tensión de cizallamiento en condiciones de flujo en dos dimensiones a ser el 97,5% de la tensión de cizallamiento en flujo unidimensional, h / w debe ser igual a 0,05. Con las dimensiones de nuestra cámara de flujo diseñado de 1,7 cm de ancho y 166 a 267 m de altura, se cumplen estos criterios. La presión varía sólo en la dirección del flujo, si no hay gradientes de presión lateral en la entrada. Esto se puede evaluar el uso de tintes o las partículas en la trayectoria del flujo. Además, para los experimentos de flujo continuo, un amortiguador de pulsaciones se inserta en el circuito de flujo. El amortiguador de pulsaciones saca la mayoría de los pulsatility causada por la bomba de rodillos en el circuito, y nos permite aproximar la suposición de flujo constante. Es de destacar que el amortiguador de pulsaciones utilizado debe ser compatible con la bomba y la tubería utilizada en el circuito, así que puede eliminar efectivamente las pulsaciones en el flujo de salida de las frecuencias específicas de la bomba de rodillos. En nuestra demostración de la Masterflex L / S amortiguador de pulsaciones consigue un flujo laminar cuando se utiliza en la línea de descarga con cualquier bomba de la serie Masterflex L / S (0 a 600 RPM) y E / P tubería de 26. Para el flujo pulsátil, una bomba programable se puede utilizar para generar formas de onda diferentes. Para el flujo pulsátil, una bomba programable se puede utilizar para generar formas de onda diferentes. Además, el circuito está diseñado de tal forma que las muestras de perfundido se pueden recoger en diferentes puntos de tiempo sin riesgo de contaminación de las células o fluido. En nuestro ejemplo, la concentración de NO 2 - se midió por quimioluminiscencia conun analizador de Ionics / Sievers Óxido Nítrico (NOA 280, Instrumentos Sievers, Boulder, CO) como se describió previamente 10. El reductor utilizado para el análisis de nitrito se yoduro de potasio en ácido acético (14,5 M de ácido acético y 0,05 M de KI), que tiene el potencial de reducción para convertir nitrato en NO, pero no es suficiente para reducir los óxidos de nitrógeno más altos, tales como nitratos y por lo tanto es relativamente específica para el nitrito. El nitrito cantidad total producida fue calculada como el producto de la concentración de producción y el volumen total del circuito, mientras que el ajuste de volumen que se pierde, mientras que la toma de muestras 6. Los siguientes pasos son esenciales para la exitosa ejecución de los experimentos de flujo: <ol class="lroman"><li> Es deseable evitar la formación de burbujas durante el flujo de set-up, ya que las burbujas tienen el potencial para arrancar las células de su superficie. Esto se puede evitar teniendo cuidado al colocar la parte superior de la cámara de flujo en la parte inferior, que es el mejorlogra manteniendo ambas paralelas entre sí y la reducción de la parte superior en la parte inferior de un movimiento sin reajustes. De este modo, pequeñas burbujas de aire que puedan estar presentes y / o flotando en el canal de flujo, se desviarán en la trampa de burbujas en cada extremo de la carcasa de aluminio. </li><li> Es importante asegurarse de que el tubo de salida en el depósito llega hasta el fondo del embalse. De lo contrario, el aire puede ser absorbido en el tubo que conduce desde el depósito a la cámara si el nivel de perfusión cae ligeramente por debajo del extremo del tubo. </li><li> El investigador debe estar familiarizado con la dirección del flujo de la bomba para que la bomba no querer correr en la dirección opuesta al inicio del flujo, lo que resultaría en aire que es aspirado en el circuito y la cámara. </li><li> Para evitar la formación de espuma (debido a las proteínas desnaturalizadas contenidas en el suero) se recomienda bajar la tubería que va desde la cámara al depósito de aproximadamente una pulgada por encima de la perfusate nivel en el depósito. Sin embargo, mantenerlo por encima del nivel medio del flujo le permite verificar el flujo en el depósito durante el experimento. </li><li> Al atornillar las piezas de cámara juntos, es importante captar firmemente la caja con una mano mientras se utiliza el destornillador eléctrico con la otra mano. Tenga en cuenta que el movimiento del destornillador eléctrico se traducirá en el par que tiene el potencial de &quot;tirar la cámara alrededor de&quot; una vez que se aprieta el tornillo. </li><li> Para evitar la formación de ondas de presión en el circuito y el levantamiento de las células de su superficie, asegúrese de que todas las llaves de paso están abiertas antes de iniciar el flujo. </li><li> Especialmente para estudios de flujo a largo plazo (&gt; 48 horas) se recomienda utilizar el tubo más difícil y más resistentes que se insertan en el cabezal de la bomba para prevenir la rotura de la tubería. </li><li> Es posible que la tubería &#39;migra&#39; en el interior del cabezal de la bomba debido a la mala cabeza de la bomba ajusta los dientes. Por lo tanto le sugerimos prestar atención a la forma en la bañeraING se asegura en el cabezal de la bomba y el marcado de cada extremo del tubo con un marcador de tal manera que usted puede notar fácilmente si el tubo está &quot;tirado en la &#39;o desplazado durante el experimento. </li><li> Siempre revise cuidadosamente cada conector individual del circuito y la cámara antes de comenzar la perfusión con el fin de evitar la fuga de perfusión durante un experimento, debido a una conexión defectuosa. Esto es especialmente importante para los conectores de entrada y salida de amortiguadores de pulso! </li><li> Recuerde que debe limitar la exposición de la luz si se utiliza marcadores fluorescentes. </li></ol> Una posible limitación de nuestra cámara de flujo es que la altura es determinada por la altura del canal de mecanizado en el aluminio. Sin embargo, esto tiene la ventaja de no tener que verificar y ajustar la altura del canal antes de cada experimento y por lo tanto, simplifica los cálculos de esfuerzo cortante con sólo ajustar el caudal de la bomba al valor deseado. Dependiendo de los objetivos de su investigación, puede ser deseable paraaumento de la tensión de corte, sin aumento de velocidad de la bomba. En este caso se recomienda aumentar la viscosidad de la perfusión, por ejemplo, la adición de dextrano en el medio 11. Una posible limitación del circuito de flujo es el gran volumen de medio utilizado, que puede ser problemático cuando se trata de cuantificar las concentraciones muy pequeñas de metabolitos celulares. Aunque no se muestra aquí, es posible reducir sustancialmente el volumen de circuitos mediante el uso de un pequeño embalse y amortiguador de pulsaciones y la disminución de longitud de la tubería y el diámetro. Además, hay otros sistemas disponibles en el mercado que pueden utilizarse para aplicar la tensión de corte de fluido de las células en cultivo. Microfluidos basada en los sistemas, por ejemplo, el sistema de BioFlux Fluxion, permitir el análisis simultáneo de las células en diferentes canales de flujo de microfluidos cargado con solución en placas que actúan como entrada y salida de depósitos de estos canales 12,13,14. Sin embargo, estos y otros microsistemas de fluidos no son compatibles con el microscopio estándar y no permite la recuperación de un número suficiente de células para nuevos experimentos, como RT-PCR o Western Blot. Además, es menos fácil de usar, el costo mínimo de $ 40.000 y puede llegar a un total de más de $ 100,000, dependiendo del equipo accesorio. Dos sistemas macrofluidic disponibles de la Corporación FlexCell Internacional, el Streamer FlexCell y los sistemas de FlexFlow, se han utilizado con éxito para estudiar las células endoteliales 15,16,17, las células del anillo 18 y los fibroblastos 19 bajo condiciones de flujo de fluidos. Un tercer sistema, disponible a través de GlycoTech, se ha utilizado para estudiar la adhesión de células tumorales 20 y adhesión de los leucocitos de 21 a monocapas endoteliales. El sistema de Streamer permite a varias diapositivas que se ejecutan bajo las condiciones de estrés misma corte de una vez, pero carece de una ventana de visualización y - a diferencia de nuestrosdiseño - no permite la visualización en tiempo real de las células bajo flujo. El sistema FlexFlow tiene una ventana de visualización, sino que requiere un microscopio vertical, que podría no ser el microscopio estándar que se utiliza en la mayoría de los laboratorios. Además, el sistema FlexFlow requiere un cubreobjetos recubiertos de células que se invierte cuando se coloca en la cámara de flujo. Esto impide la visualización de las células fluorescentes en una superficie opaca, como el titanio recubierto de vidrio, que se demuestra en nuestro estudio. Por último, la cubierta se desliza especializados tienen que ser comprados específicamente para el sistema FlexFlow, que está en el rango de precio de varios miles de millones de dólares, similar al sistema de Streamer FlexCell. GlycoTech ofrece circulares y rectangulares placas paralelas cámaras de flujo, que son mucho menos costosos, pero fabricados en material acrílico fundido que no pueden ser convenientemente madre autoclave como la nuestra cámara. Es de destacar que otras cámaras de flujo que se han descrito para ser autoclavableparece poco práctico, ya que requieren especial lentes microscópicas 22,23. El sistema utiliza GlycoTech juntas de goma de silicona se interpuso entre las placas superior e inferior, que se cambio en el espesor con el uso repetido y por lo tanto, cambiar la altura de la cámara a través del tiempo (el fabricante recomienda la adquisición de otras nuevas después de cada diez usos). Nuestra cámara de aluminio con una función de anillos permite la completa oposición de las placas superior e inferior y se asegura la altura de la cámara constante entre los experimentos. Por último, las bombas de vacío son necesarias para lograr un sellado a prueba de fugas en muchos diseños de cámara de flujo, incluyendo las cámaras de GlycoTech, que no son necesarios en nuestro diseño. Mientras que no se muestra aquí, la cámara de flujo se pueden mantener bajo el microscopio durante el experimento de caudal de imágenes en tiempo real de la adhesión celular y / o comportamiento. Si se desea, se recomienda utilizar lámparas de calor o una almohadilla de calefacción en la cámara para mantener la temperatura perfundido a 37 ° C. Pielallí, la bomba de rodillos puede ser sustituida por una bomba de jeringa, si no &quot;recirculación&quot; de cualquiera de las células o de sus metabolitos o fármacos en investigación o agentes que se desea 24. También es posible que el flujo de las células etiquetadas de forma diferente en las células adherentes, por ejemplo, las plaquetas fluorescente sobre una capa de EPCs confluentes (utilizando el ensayo de plaquetas descrito por Achneck et al. 6,25) para evaluar la célula a célula de interacción bajo una tensión cortante del fluido. Nuestra cámara de flujo combina las valiosas aportaciones de otras cámaras de flujo disponibles, tales como un puerto de muestreo perfusión y un visor, tiene la importante ventaja de la compatibilidad, ya sea con un microscopio invertido o vertical. Es totalmente autoclavable y permite experimentos repetidos a la altura de la cámara constante y sin necesidad de bombas de vacío para obtener un sellado hermético.

<table border="1"><tbody><tr><td> Productos / Reactivos </td><td> Empresa </td><td> Producto # </td></tr><tr><td> 10 ml jeringa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Vía Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml jeringa </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> Camino de 4 Llaves </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Aleación de aluminio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> De cultivo celular platos (4-así, rectangular) </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Celular Rastreador de naranja </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Research Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Adaptador Luer hembra </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Botellas de vidrio (250 ml) con tapa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubos duro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst manchas Solución </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptador Luer macho </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1x Media </td><td> Cellgro </td><td> 15 a 100 CV </td></tr><tr><td> Accesorios de púas de polipropileno </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Amortiguador de impulsos </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Bomba-Drive (Masterflex L / S de velocidad variable impulsar la economía) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Bomba-Head (Masterflex Fácil cabezal de la bomba de carga) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Diapositiva </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubos flexibles </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Acid Orange nucleicos manchas </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Neutralizar la solución de tripsina </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

El objetivo general de este método consiste en describir una técnica de someter a las células adherentes a las condiciones de flujo laminar y evaluar su respuesta al corte de fluido y cuantificables tensiones 1. Nuestro diseño de la cámara de flujo y un circuito de flujo (Fig. 1) contiene una zona de visualización transparente, que permite realizar pruebas de adhesión celular y la imagen de la morfología de las células inmediatamente antes del flujo (Fig. 11A, B), en varios momentos durante el flujo (Fig. 11C) , y después de flujo (Fig. 11D). Estos experimentos se ilustran con el cordón umbilical humano derivados de la sangre las células progenitoras endoteliales (CPE) y CPE porcino 2,3. Este método también es aplicable a otros tipos de células adherentes, por ejemplo, células de músculo liso (SMC) o fibroblastos. La cámara y todas las partes del circuito son fácilmente esterilizados con autoclave de vapor. A diferencia de otroscámaras, por ejemplo, cámaras de microfluidos, un gran número de células (&gt; 1 millón, dependiendo del tamaño celular) se puede recuperar después del experimento de flujo bajo condiciones estériles para el cultivo celular o de otros experimentos, por ejemplo, ADN o la extracción de ARN, o inmunohistoquímica (Fig. 11E), o microscopía electrónica de barrido 5. El esfuerzo de corte se puede ajustar mediante la variación de la velocidad de flujo de la perfusión, la viscosidad del fluido, o la altura y la anchura del canal. Este último puede reducir el volumen de líquido o de las necesidades de la celda al tiempo que garantiza que el flujo unidimensional se mantiene. No es necesario medir la altura de la cámara entre los experimentos, ya que la altura de la cámara no depende de la utilización de las juntas, lo que aumenta enormemente la facilidad de múltiples experimentos. Además, el diseño del circuito permite fácilmente la toma de muestras para el análisis de perfusión y / o cuantificación de los metabolitos secretados por las células en la exposición de fluidos esfuerzo cortante, por ejemplo, óxido nítrico (Fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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Differential Analysis of Fluid Flow

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43.2K vistas.  Duke University Medical Center. Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

Video: Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Cuentas de la separación y las células en varios canales de dispositivos de microfluidos Con dielectroforesis y de flujo laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Investigación

Bioingeniería

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Un dispositivo de cámara de flujo tridimensional Novel para el Estudio de quimioquinas-dirigida extravasación de células circulantes en condiciones de flujo fisiológicas

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico para dimensionamiento de nanopartículas de oro en suspensión

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imágenes de flujo sanguíneo con Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...