この方法は、分泌速度が時間とともにどのように変化するか、および細胞が時間的に変化する固体シグナルにどのように反応するかを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、その低コスト、ほとんどトレーニングを必要とせず、豊富なシステムのセットアップを新しい実験に適応できることです。1つのシリンジにバックグラウンド溶液を充填し、最初のシリンジポンプにロードすることから始めます。
別のシリンジにトレーサー溶液を充填し、2番目のシリンジポンプにロードします。ルアーコネクタを使用して、両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。活栓をバックグラウンド溶液に閉じ、開いているポートから滴り落ちるまでトレーサー溶液を活栓にポンプで送り込みます。
ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。シリンジポンプの移動バーがシリンジプランジャーに対して押し上げられ、ポンプが始動したときに流れがすぐに開始されるようにします。トレーサー溶液への活栓を閉じ、残りのトレーサー溶液がすべて開いたポートから洗い流されるまで、バックグラウンド溶液を活栓にポンプで送り込みます。
ポンプを停止し、シリンジをさらに調整しないでください。RTD 解析に必要なフローシステムコンポーネントを設定します。端部をピペットチップディスペンサーに挿入し、完全に満たされるまでバックグラウンド溶液をコンポーネントを通してポンプで送ります。
トレーサー溶液のポンプを所望の流量に設定します。バックグラウンド溶液への活栓を閉じ、トレーサー溶液の流れを開始します。同時に、分数コレクターを起動します。
トレーサー溶液の流れを短時間継続して、トレーサーのインパルス入力を近似します。1時間あたり1ミリリットルの流量のRTDには、10分のパルス持続時間が推奨されます。トレーサー溶液パルス期間の終了時にトレーサー溶液ポンプを停止します。
活栓をトレーサー溶液にすばやく閉じ、同じ流量でバックグラウンド溶液の流れを開始します。すべてのトレーサーがシステムを通過して収集された画分に入るまで、バックグラウンド溶液が流れてフラクションを収集できるようにします。無菌条件下で、針を引き上げた状態で、針でストッパーをウェルプレート培養物に挿入します。
ストッパーが所定の位置に収まったら、出口針の高さが安定した液面を決定するので、針を灌流のための所望の高さまで下げる。針をオスのルアーキャップでキャップし、ウェルプレート全体を37°Cに設定したインキュベーターに入れて使用してください。灌流に使用する培地を2つ用意し、最初に分注する培地を1つ、もう1つの培地を2つとして標識する。
灌流する各培養物について、1つのシリンジに培地1つを充填して、その年金の期間全体に加えて、最初に灌流システムを満たすのに十分な量を持続させる。2番目の注射器をミディアム2で満たして、その年金の期間全体を持続させます。両方のシリンジを4方向活栓の3つのポートのうちの2つに接続します。
シリンジを活栓に接続するためのチューブの長さが必要な場合があります。活栓を準備するには、媒体 1 の活栓を閉じ、開いたポートから滴り落ち始めるまで媒体 2 を活栓に分配します。次に、培地2の活栓を閉じ、残りの培地2がすべてオープンポートから洗い流されるまで、媒体1を活栓に分配します。
上流のチューブを、メスからバーブへのルアーコネクタを使用して、開いた活栓ポートに取り付けます。チューブのもう一方の端にオスからバーブルへのルアーコネクタを挿入します。上流チューブが培地で満たされるまでシリンジから培地1つを分配し、先に実証したように下流チューブの調製を続行する。
下流チューブの一端にオスからバーブルへのルアーコネクタを挿入し、メスのルアーキャップでキャップします。準備されたすべてのチューブ、シリンジ、ウェルプレートを、灌流に使用するインキュベーターに慎重に持参してください。シリンジポンプとフラクションコレクターをインキュベーターの近くの所望の場所に置きます。
シリンジポンプをインキュベーターの上または近くに置き、フラクションコレクターをインキュベーターの隣のポートの近くに置きます。シリンジをポンプにセットします。すべての上流および下流のチューブのキャップされた端を束ね、インキュベーターの外側からポートを介して内側に押し込みます。
下流チューブの開放端をフラクションコレクターのマルチヘッドディスペンサーのディスペンシングピペットチップに挿入します。インキュベーター内では、上流のチューブの弛みをできるだけインキュベーターに引き込み、流れる媒体が熱と二酸化炭素を受け取ることができるチューブの長さを最大にします。差し込まれた井戸ごとに、針と、その井戸の上流および下流のチューブのキャップをすばやく外し、ルアーコネクタと一緒に取り付けます。
すべての部品が接続されたら、シリンジポンプを比較的高速で短時間稼働させ、すべての流れが正しく流れていることを確認します。この時点で、培地でいっぱいの下流チューブで実験を開始したい場合には、全てが満たされるまでポンプを稼働させ続け、そうでなければ、ポンプを停止する。培地1のシリンジポンプ流量とフラクション収集の頻度を設定し、両方の機械を同時に起動して実験を開始します。
培地源を交換する必要がある場合は、ミディアム1用のシリンジポンプをすばやく停止します。活栓をミディアム1に閉じ、ミディアム2用のシリンジポンプを起動します。後で必要に応じて、ソースを同様にミディアムソースに戻します。
目的の実験期間分の分画を収集します。2つのRTD実験からのフラクション中のトレーサー濃度を測定し、データMATLABスクリプトからRTDに入力して2つのRTDを生成します。単一のチューブと直列の複数のチューブは、単一の軸分散モデルによってよくフィットし、灌流された48ウェルプレートをラインに追加すると、無視できる偏差が生じ、1メートルのチューブRTDとシステム全体のRTDの両方が軸方向分散関数によって適合しました。
1メートルのチューブRTDデータにフィットした軸分散モデルを使用して、モデル適合度が低い例を実証し、データとともにプロットしました。最初のパラメータの推測は、タウが灌流システムの体積を体積流量で割った値にほぼ等しい良好なモデル適合を生成するために変更されました。TNF-αの90分間のパルスをシステムへの入力信号として定義し、1メートルのチューブRTDで畳み込んで、ウェルプレート入口でのTNF-α信号を決定しました。
入力信号もシステム全体のRTDと畳み込み、収集されたフラクション中のシステムの出口におけるTNF-α信号を決定した。HEK 293細胞は、NF−kappaB応答エレメントを含むプロモーターによって駆動されるGLucを分泌するように操作した。実験は、TNF−α曝露後のNF−κBによって駆動されるGLuc発現の有意な発現増加および遅い減少を明らかにした。
システムのバリエーションは、シグナルの入力や細胞をpharma-hu結合溶質プロファイルにさらす必要がない実験のためのより簡単なセットアップを含む、付随する論文で説明されています。
