Este método ajuda a entender como as taxas de secreção mudam com o tempo e como as células respondem ao tempo variando sinais sólidos. As principais vantagens dessa técnica são que seu baixo custo, requer pouco treinamento e a configuração do sistema de profusão pode ser adaptada para novos experimentos. Comece preenchendo uma seringa com uma solução de fundo e carregue-a na primeira bomba de seringa.
Encha outra seringa com solução de rastreador e carregue-a na segunda bomba de seringa. Conecte ambas as seringas a duas das três portas de uma torneira de quatro vias usando conectores luer. Feche a torneira para a solução de fundo e bombeie a solução do rastreador para dentro da torneira até que ela escorra a porta aberta.
Pare a bomba e não ajuste ainda mais a seringa. Certifique-se de que a barra de movimento das bombas de seringa seja empurrada contra os êmbolos da seringa para que o fluxo comece imediatamente quando a bomba é iniciada. Feche a torneira para a solução do rastreador e bombeie a solução de fundo para dentro da torneira até que toda a solução de rastreador residual tenha sido liberada para fora da porta aberta.
Pare a bomba e não ajuste ainda mais a seringa. Configure o componente do sistema de fluxo desejado para análise de RTD. Insira a extremidade em um distribuidor de ponta de pipeta e bombeie a solução de fundo através do componente até que esteja totalmente preenchida.
Coloque a bomba para a solução do rastreador à taxa de fluxo desejada. Feche a torneira para a solução de fundo e inicie o fluxo da solução rastreadora. Ao mesmo tempo, inicie o coletor de frações.
Continue o fluxo de solução rastreadora por um curto período de tempo para aproximar uma entrada de impulso do rastreador. Recomenda-se uma duração de pulso de 10 minutos para RTDs a uma vazão de um mililitro por hora. Pare a bomba de solução do rastreador no final do período de pulso da solução do rastreador.
Feche rapidamente a torneira para a solução de rastreador e inicie o fluxo da solução de fundo na mesma taxa de fluxo. Permita que a solução de fundo flua e colete frações até que todo o rastreador passe pelo sistema e pelas frações coletadas. Em condições estéreis, insira as rolhas com agulhas nas culturas da placa do poço com as agulhas puxadas para cima.
Depois que a rolha estiver no lugar, abaixe as agulhas para a altura desejada para perfusão, pois a altura da agulha de saída determina o nível líquido estável. Tampe as agulhas com tampas de luer machos e mantenha toda a placa em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius até o uso. Prepare as duas mídias a serem utilizadas para perfusão, rotulando o meio que será dispensado primeiro como um e o outro médio dois.
Para que cada cultura seja perfundida, encha uma seringa com médio para durar toda a duração de sua dispensação mais volume suficiente para preencher inicialmente o sistema de perfusão. Encha uma segunda seringa com dois médios para durar toda a duração de sua dispensação. Conecte ambas as seringas a duas das três portas de uma torneira de quatro vias.
Um comprimento de tubulação para conectar as seringas às torneiras pode ser necessário. Prepare as torneiras fechando a torneira para um médio e distribuindo dois médios na torneira até que comece a escorrer pela porta aberta. Em seguida, feche a torneira para dois médios e dispense um médio na torneira até que todos os dois meios residuais sejam liberados da porta aberta.
Conecte a tubulação a montante à porta da torneira aberta usando um conector feminino para barb luer. Insira um conector macho para barb luer na outra extremidade do tubo. Dispense um médio da seringa até que o tubo a montante esteja cheio de médio e prossiga com a preparação de tubos a jusante, como demonstrado anteriormente.
Insira um conector macho para barb luer em uma extremidade da tubulação a jusante e tampe-o com uma tampa de luer fêmea. Leve cuidadosamente todas as tubulações preparadas, seringas e a placa do poço para a incubadora que será usada para perfusão. Coloque a bomba de seringa e o coletor de frações nos locais desejados próximos à incubadora.
Coloque a bomba de seringa em cima ou perto da incubadora e coloque o coletor de frações ao lado da incubadora perto do porto. Coloque as seringas na bomba. Junte as extremidades tampadas de todos os tubos rio acima e rio abaixo e empurre-os do lado de fora da incubadora para o interior através da porta.
Insira as extremidades abertas dos tubos a jusante nas pontas de pipeta de distribuição do distribuidor multi-cabeça do coletor de frações. Dentro da incubadora, puxe o máximo de folga possível dos tubos a montante possível para a incubadora para maximizar o comprimento da tubulação através da qual o meio fluindo pode receber calor e dióxido de carbono. Para cada bem plugado, despreze rapidamente as agulhas e os tubos rio acima e rio abaixo para que bem, em seguida, conecte-os junto com seus conectores luer.
Uma vez que todas as peças estejam conectadas, execute brevemente a bomba de seringa a uma velocidade relativamente alta para garantir que todos os fluxos estejam fluindo corretamente. Neste ponto, se desejar iniciar o experimento com os tubos a jusante cheios do meio, continue a operar a bomba até que todos estejam cheios, caso contrário, parem a bomba. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa para médio e a frequência da coleta de frações e inicie ambas as máquinas simultaneamente para iniciar o experimento.
Quando a fonte média precisar ser alterada, pare rapidamente a bomba de seringa para a média. Vire a torneira fechada para a média e inicie a bomba de seringa para dois médios. Se desejar mais tarde, mude a fonte de volta para média.
Colete frações para a duração desejada do experimento. As concentrações de rastreadores nas frações de dois experimentos de RTD foram medidas e a entrada no RTD a partir do script MATLAB de dados para produzir os dois RTDs. Tubos únicos e várias peças de tubulação em série se encaixam bem por um único modelo de dispersão axial e a adição de uma placa de 48 poços perfumada na linha causou desvio insignificante permitindo que tanto o tubo de um metro RTD quanto todo o RTD do sistema se encaixassem por funções de dispersão axial.
Um exemplo de ajuste de modelo ruim foi demonstrado usando o modelo de dispersão axial instalado nos dados RTD do tubo de um metro e foi plotado ao lado dos dados. Os palpites iniciais do parâmetro foram alterados para produzir um bom ajuste de modelo onde tau era aproximadamente igual ao volume do sistema de perfusão dividido por sua taxa de fluxo volumétrico. Um pulso de 90 minutos de TNF-alfa foi definido como o sinal de entrada para o sistema e foi convolved com o rtd de tubo de um metro para determinar o sinal TNF-alfa na entrada da placa do poço.
O sinal de entrada também foi convolved com o RTD de todo o sistema para determinar o sinal TNF-alfa na saída do sistema nas frações coletadas. As células HEK 293 foram projetadas para segregar o GLuc conduzido por um promotor contendo o elemento de resposta NF-kappaB. O experimento revelou um aumento significativo de expressão e uma diminuição lenta na expressão GLuc impulsionada por NF-kappaB após a exposição TNF-alfa.
Variações do sistema são descritas em papel de acompanhamento, incluindo uma configuração mais simples para experimentos que não requerem sinais de entrada e exposição de células a perfis de solute conectivos pharma-hu.
