Este modelo permitirá a los investigadores en las etapas preclínicas críticas determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana de las nuevas formulaciones, y les da a los investigadores un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos. Este modelo permite resultados reproducibles rápidos en un entorno de herida representativo. Reduce la necesidad de animales criados especialmente y facilita la traducción más rápida de antimicrobianos tópicos para infecciones de heridas a la clínica.
Los principales desafíos son la contaminación y la destreza. Una técnica aséptica estricta y la paciencia con el procesamiento de tejidos son esenciales; se necesita una eliminación precisa y decidida del colgajo para el éxito de este método. Comience con la desinfección de los fórceps exponiéndolos a la esterilización por calor seco a 200 grados centígrados durante una hora.
Autoclave toda la cristalería a 121 grados centígrados durante 15 minutos antes de su uso. Desinfecte la sección frontal de la lámpara vertiendo aproximadamente 100 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM en el área de la muestra. Afeite la sección de la frente con cortapelos eléctricos, seguido de un lavado con 200 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM.
Limpie el área con etanol y un rollo azul, y cubra el área de muestra con crema depilatoria. Después de 35 minutos, raspe suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúe el área de la muestra. Repita el proceso de depilación si queda una cantidad significativa de vello.
Enjuague el área de muestra limpia con 200 mililitros de solución de dióxido de cloro seguido de etanol y un rollo azul. Use un punzón de biopsia estéril de ocho milímetros para cortar una muestra de piel de ocho milímetros del área preparada. A continuación, retire la muestra con fórceps estériles y bisturí de cuchilla número 15, asegurándose de que se elimine toda la grasa cutánea.
Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 litros lleno de PBS estéril. Luego transfiéralos a tubos estériles de 50 mililitros llenos con 50 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM. Invierta el tubo dos veces y déjelo esterilizar durante 30 minutos.
Transfiera las muestras a un tubo de 50 mililitros lleno de 40 mililitros de PBS estéril. Después del lavado de PBS, coloque cada muestra de piel en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos. Agregue 350 microlitros del medio precalentado en un pozo, mientras mantiene la muestra en la interfaz aire-líquido.
Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas antes de colocar la placa para incubación en una incubadora de tejido humidificado al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo y enjuague las muestras en 500 microlitros de PBS estéril. Retire los antibióticos residuales de la muestra tratándolos con medios libres de antibióticos al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas.
Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en los medios libres de antibióticos, deseche la muestra. A continuación, prepare un tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril. Luego transfiera varias colonias de Staphylococcus aureus de una placa de agar fresco de S.aureus al caldo, e incube el tubo a 37 grados centígrados y 150 RPM durante 18 horas.
Después de centrifugar los tubos a 4, 000 G durante tres minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de PBS estéril. Repita el lavado de PBS dos veces antes de ajustar el inóculo a una densidad óptica de 0,6 a longitudes de onda de 600 nanómetros utilizando PBS estéril. Confirme la carga de inóculo mediante un recuento manual de placas viables.
Para infectar la muestra de piel, prepare una placa fresca de 24 pocillos con 400 microlitros de medios libres de antibióticos precalentados y agregue los insertos de 24 pocillos con pinzas estériles. Retire el medio de las muestras de piel. Lavarlos con 500 microlitros de PBS estéril y retirar el lavado.
Use fórceps estériles para sostener suavemente la muestra en el fondo del pozo. Use una biopsia por punción de cuatro milímetros para perforar la muestra de piel a una profundidad aproximada de uno a dos milímetros y hacer un colgajo central de la herida. Luego use un bisturí de hoja número 15 y pinzas de tejido Allis de dientes estériles para eliminar la capa superior del colgajo de la herida.
Una vez que todas las muestras hayan sido heridas, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Pipetear 15 microlitros del inóculo bacteriano en el lecho de la herida antes de incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de tejido humidificada. Para períodos de incubación más largos, retire el medio, reemplácelo con medios frescos cada 24 horas e incube las placas en las mismas condiciones.
Para determinar la carga bacteriana, retire los medios del fondo de los pocillos. Y usando pinzas estériles, transfiera cada muestra a un tubo separado de 50 mililitros lleno de un mililitro de PBS estéril. Luego separe las bacterias de la superficie del lecho de la herida homogeneizando la superficie de la muestra con un homogeneizador de punta fina.
Asegúrese de que el lecho de la herida esté en contacto directo con la punta del homogeneizador. Una vez que se procesan todas las muestras, haga un vórtice de cada muestra antes de transferir 20 microlitros de homogeneizado al pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenga 180 microlitros de PBS estéril. Diluir en serie cada homogeneizado de muestra de 1 veces 10 a 7 negativo, y pipetear 10 microlitros del homogeneizado diluido en una placa de agar de soja tríptico por triplicado.
Incubar la placa de agar de soja tríptica a 37 grados centígrados, y después de 18 horas, contar el número de colonias para determinar las unidades formadoras de colonias o UFC para cada muestra. Se identificó un régimen apropiado de esterilización de la piel utilizando diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo. La integridad del tejido se monitorizó mediante histología, seguida de tinción con hematoxilina y eosina inmediatamente después del tratamiento.
Un tratamiento de 30 minutos con dióxido de cloro fue el tratamiento más efectivo, con esterilización reproducible del tejido de la piel mientras se preserva la integridad del tejido. Una película blanca en el lecho de la herida era evidente en el tejido 48 horas después de la infección. Aunque el modelo de rasguño albergaba un mayor número promedio de UFC después de 24 horas, la técnica de eliminación de heridas con colgajo produjo resultados más consistentes.
Después de 48 horas, se recuperaron aproximadamente 100 veces más UFC bacterianas del tejido herido en comparación con el inóculo, lo que indica una infección exitosa. Las secciones histológicas teñidas de Gram del tejido infectado indicaron la presencia de células de S.aureus en el lecho de la herida, que estaba ausente en las secciones de tejido no infectado. Después de este procedimiento, se puede realizar inmunohistoquímica para estudiar la respuesta tisular, tinción de Gram modificada para visualizar la localización bacteriana y recuentos de placas viables después de la exposición a antimicrobianos para probar la eficacia antimicrobiana.
Para los investigadores que desarrollan nuevos antimicrobianos, este modelo proporcionará un mayor control de la optimización del plomo, reducirá la dependencia de ensayos en animales costosos y estrictamente regulados, y permitirá la rápida traducción de los antimicrobianos a la clínica.
