Estos modelos se pueden implementar para evaluar varios aspectos de la respuesta curativa de la herida, incluyendo la cinética celular y citoquina y el cierre de la herida. El modelo de esponja PVA permite la recuperación de millones de leucocitos de heridas para análisis fenotípicos y funcionales, mientras que el modelo de escisión de la piel de la cola permite la fácil visualización de heridas de curación lenta. Los modelos de esponja de PVA y de la herida de cola escisional se pueden utilizar junto con condiciones comorbilidades, como diabetes o neumonía, para comprender su impacto en la cicatrización de heridas.
Demostrando los procedimientos con Meredith Crane estará Bill Henry, un asistente de investigación de mi laboratorio. Antes de comenzar el experimento, utilice tijeras para cortar hojas de esponja de PVA en trozos de ocho por cuatro milímetros. Rehidratar las piezas de esponja en PBS estéril en un vaso de precipitados durante 10 minutos antes de autoclave esterilizar las esponjas en el PBS.
Cuando las esponjas se hayan enfriado, almacene las esponjas sumergidas en PBS a cuatro grados centígrados. El día del procedimiento, coloque seis esponjas por animal experimental en un plato de cultivo estéril en una capucha de flujo laminar estéril, y confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anesthetizado, de ocho a 12 semanas de edad, macho, C57-Negro/6. Pida a un asistente que utilice cortadoras para eliminar el cabello a lo largo del dorso y la gasa estéril para aplicar solución de povidona-yodo en el área afeitada dos veces, seguida de una sola aplicación de 70% de etanol.
A continuación, el asistente debe transferir el ratón a cortinas quirúrgicas estériles colocadas sobre una almohadilla calentada. Usar guantes estériles, usar fórceps para alejar la piel dorsal del tejido subyacente y utilizar tijeras quirúrgicas estériles para hacer una incisión de dos centímetros a lo largo de la línea media dorsal aproximadamente dos centímetros antes de la base de la cola. Manteniendo la incisión abierta con fórceps estériles, utilizar tijeras quirúrgicas estériles, curvadas, con puntas contundentes para formar un bolsillo subcutáneo a lo largo del dorso en una de las posiciones como se indica en la figura.
Una vez insertadas las tijeras, abre y cierra las puntas dos veces para formar un bolsillo lo suficientemente grande como para sostener una esponja insertada. Cuando se haya creado el bolsillo, utilice tijeras quirúrgicas estériles para exprimir suavemente una esponja de PVA en el plato de cultivo para eliminar el exceso de PBS. A continuación, levante la esponja por una esquina y, con la curva sostenida por las tijeras, coloque la esponja en el bolsillo subcutáneo.
Cuando se hayan colocado las seis esponjas como se ha demostrado, utilice fórceps estériles para pellizcar la piel dorsal incisa juntas, y cierre la incisión con dos clips de acero inoxidable. Para el aislamiento del líquido de esponja PVA, de uno a 14 días después de la implantación, retire las grapas quirúrgicas y abra la incisión con fórceps dentados. Use tijeras para extender la incisión a lo largo de la línea media dorsal, y use fórceps para extraer una esponja de su bolsillo subcutáneo.
Coloque la esponja en el barril de una jeringa de cinco mililitros anidada en un tubo de cultivo de 16 mililitros sobre hielo, y utilice tijeras para desasociar cualquier tejido conectivo que permanezca adherente a la superficie de la esponja, según sea necesario. Cuando todas las esponjas se han extraído y transferido como se ha demostrado, centrifugar el tubo de cultivo para recoger el líquido de la herida. Para aislar las células de las esponjas PVA, después de recoger las esponjas como acaba de demostrar, colóquelas en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros del medio de recolección de HBSS.
Una vez recogidas todas las esponjas, decantar la suspensión de esponja en una bolsa de licuadora de 80 mililitros, y cuelgue la bolsa de la escotilla de la licuadora de paletas para que las paletas golpeen las esponjas y el medio. Ajuste la licuadora de paletas para que funcione en alto durante 60 segundos y pulse start. Cuando la licuadora se haya detenido, apriete las esponjas de la bolsa para liberar completamente el medio y utilice una pipeta para transferir el medio de la bolsa de la licuadora de nuevo al tubo de 15 mililitros.
Ajuste los ajustes de la licuadora de paletas para que funcione durante 30 segundos en alto, y agregue cinco mililitros de medio a la bolsa de la licuadora. Repita el proceso de estanco dos veces más antes de centrifugar el tubo del medio recogido. Un gránulo rojo de células y glóbulos rojos debe ser visible en la parte inferior del tubo cónico.
Mezclar 900 microlitros de agua destilada con las células durante tres a cinco segundos antes de neutralizar la lisis con 100 microlitros de 10x PBS y cuatro mililitros de 1x PBS. Recoger las células por centrifugación, y resuspender el pellet de células blancas en el medio apropiado para el análisis aguas abajo. Para crear una herida en la piel de la cola, después de confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie en el ratón anestesado, de ocho a 12 semanas de edad, macho, C57-Negro/6, utilice gasa estéril para aplicar solución de povidona-yodo dos veces al sitio quirúrgico, seguido de una aplicación de 70%etanol.
Usando un marcador permanente y una plantilla prefabricada, traza una sección de 10 por tres milímetros en la superficie dorsal de la cola, a 10 milímetros de la base de la cola, y coloca el ratón en cortinas quirúrgicas estériles. Usando guantes quirúrgicos estériles, use una cuchilla de bisturí estéril para hacer una incisión de espesor completo a lo largo de los bordes derecho, inferior e izquierdo del área de la herida. Usando fórceps estériles, pela la piel extirpada lejos de la cola, y usa tijeras quirúrgicas estériles para cortar el borde superior del área de la herida.
Use gasa estéril para aplicar presión sobre la herida para detener el sangrado y aplique una película de barrera de pulverización en el lecho de la herida. A continuación, fotografíe las heridas desde una distancia fija a intervalos de tiempo regulares y analice las fotografías mediante análisis planimétrico para determinar las mediciones del área de la herida. La cirugía de implante de esponja PVA genera una respuesta inflamatoria sistémica, como lo demuestra la inducción de IL-6 en el plasma un día después de la herida.
El número de células que se pueden recuperar de las heridas de esponja PVA aumenta con el tiempo, con neutrófilos, monocitos y macrófagos que comprenden las poblaciones primarias de infiltración celular dentro de las esponjas. Los neutrófilos se identifican como células Ly6G-positivas, Siglec-F-negativas. Las células siglec-F-positivas son principalmente eosinófilos.
El Litoja de células negativas de Ly6G permite la identificación de monocitos y macrófagos F4/80 positivos. Las células F4/80-positivas se pueden diferenciar aún más por su expresión Ly6C para distinguir los monocitos inflamatorios altos Ly6C y los macrófagos derivados de monocitos bajos Ly6C. El modelo de piel de cola escisional proporciona una alternativa al método de biopsia por punción de piel dorsal para estudiar el cierre de la herida en la piel firme que carece de piel densa.
El cierre de la herida se puede cuantificar midiendo el área del lecho de la herida con el tiempo. La herida de la piel de la cola también se puede observar en sección transversal mediante análisis histológicos a través de H y E y la tinción tricromática de Masson. En estas imágenes, los márgenes laterales de la piel extirpada están indicados por las puntas de flecha en la superficie dorsal de la cola.
Para entender la cicatrización de heridas en estado estacionario, compuestos terapéuticos o intervenciones también se pueden probar a través de su inyección directamente en la esponja de PVA o a través del suministro al lecho de la herida de cola.
