En este artículo, presentamos un protocolo optimizado ex vivo de heridas en la piel humana que puede proporcionar datos importantes de eficacia como parte de una línea de traducción clínica. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación precisa de alto rendimiento de la reparación de heridas en la piel humana viva. La demostración del procedimiento estará a favor elizabeth Roberts, investigadora postdoctoral, y Alexandria Kidd, asistente de investigación de nuestro laboratorio.
Para preparar una muestra de tejido cutáneo para la herida, coloque la dermis de la piel hacia abajo en una placa de Petri de 90 milímetros y use tijeras estériles para eliminar el tejido adiposo. Cuando se haya eliminado toda la grasa, coloque la piel en 25 mililitros de HBSS suplementada con antibióticos durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación intermitente para eliminar cualquier sangre residual en el tejido adiposo. Después de 10 minutos, enjuague la piel en 25 mililitros de DPBS.
Después de 10 minutos, repita el enjuague HBSS sin antibióticos y luego realice un enjuague final en 25 mililitros de DPBS. Luego coloque una membrana de filtro de nylon estéril en la pila de almohadillas absorbentes y seque el lado dérmico de la piel en una gasa estéril en una placa de Petri de 90 milímetros para eliminar el DPBS residual. Coloque la dermis de la piel seca boca abajo en una tapa limpia de placa de Petri de 90 milímetros para eliminar cualquier DPBS residual y seque la epidermis con una gasa estéril fresca.
Para crear una herida, presione un punzón de biopsia de dos milímetros contra la piel mientras mantiene la piel firme y se retuerce suavemente. Usando unas fórceps curvas de tejido dentado, recoja cada lado de la herida de aproximadamente dos milímetros de diámetro y enganche las tijeras curvas iris debajo de la herida. Use una punción de biopsia de seis milímetros para biopsiar alrededor de la herida central de dos milímetros para crear un explante de seis milímetros con un grosor parcial de dos milímetros de herida en el centro.
Luego, coloque la epidermis de explante de la herida hacia arriba en la pila de membrana del filtro de nylon para una incubación de uno a siete días a 32 a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para la tinción fluorescente, recoja los explantes de la herida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de fijador de la piel por tubo e incube los explantes durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, reemplace el fijador con un mililitro de tampón de lavado de manchas.
Después del lavado, cubra cada muestra con aproximadamente 150 microlitros de tampón de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de retirar el tampón de bloqueo, agregue 150 microlitros de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo por tubo e incube los explantes de la herida durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, enjuague las muestras con 500 microlitros de tampón de lavado de tinción que contenga azida de 0.2% de sodio seguido de tres enjuagues en tampón de lavado regular.
Después del lavado, agregue 150 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con florescencia apropiado diluido en tampón de lavado de tinción a cada pozo durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague el explante tres veces durante 30 minutos en 500 microlitros de tampón de lavado de tinción por lavado antes de contramantar cada explante con 150 microlitros de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave el explante dos veces durante 30 minutos con 500 microlitros de tampón de lavado por lavado.
Para obtener imágenes de explante, coloque una placa de Petri de 60 milímetros en la plataforma de imágenes de un microscopio confocal y agregue una capa de aproximadamente un mililitro de DPBS a la placa. Use forrcepciones para transferir los explantes de la herida al plato. Después de configurar el software de imágenes según corresponda para el experimento, coloque la herida en el centro del plano de imágenes y adquiera imágenes de las biopsias de la herida.
Para realizar imágenes de microscopio digital inalámbrico para obtener imágenes de alta calidad de una manera rentable, conecte un teléfono o computadora portátil a un microscopio digital inalámbrico. Coloque los explantes enrollados de lado hacia arriba sobre un pedazo de tejido de laboratorio y retire cualquier tampón de lavado residual de la muestra. A continuación, coloque el explante en el centro del campo de visión del microscopio y adquiera imágenes utilizando la cámara conectada.
La inmunoperoxidasa y la inmunofluorescencia se pueden usar para la tinción de tejido de montaje completo. Además, la tinción viva / muerta se puede realizar en tejido fresco y obtener imágenes antes o después de la fijación. La tinción de montura completa de las heridas se puede utilizar para determinar las tasas de cierre de la herida de una manera reproducible.
En este análisis representativo, se observó un cierre de la herida cutánea sana después de cuatro a cinco días, mientras que las heridas cutáneas diabéticas no se cerraron por completo dentro del período de análisis de siete días. La expresión de K14 alcanzó su punto máximo en el segundo día en heridas cutáneas sanas antes de disminuir rápidamente con una mayor diferenciación epidérmica. Esta reepilecialización y posterior diferenciación epidérmica se retrasó en las heridas cutáneas diabéticas.
La reforma de la barrera epidérmica temprana excluye la penetración de anticuerpos K14 dentro de las capas epidérmicas diferenciadas. Al principio del proceso de reepilialización, los queratinocitos de capa basal K14 positivos migran hacia adentro sobre la herida abierta, de modo que la epidermis más cercana al borde externo de la herida se forma antes que la epidermis más cerca del borde interno de la herida. Más adelante en la etapa de reparación, la tinción de K14 se pierde a medida que la epidermis se diferencia del exterior hacia adentro.
La tinción de montura entera también se puede utilizar para estudiar la expresión y localización de otros marcadores relevantes de la herida en la piel, así como la presencia de células inmunes de interés en el sitio de la herida en diferentes etapas de curación. Generar heridas por escisión reproducibles puede ser un desafío al principio. Aconsejamos practicar el procedimiento de herida utilizando el excedente de piel.
