Este es un paradigma de resección de tumores cerebrales que es muy necesario en la investigación preclínica sobre terapias para tumores cerebrales. Permite una resección estandarizada a través de un enfoque mínimamente invasivo, mientras que al mismo tiempo, también está acoplado a un sistema automatizado de preservación de tejidos. Este protocolo permite que el animal sobreviva después de la cirugía y, por lo tanto, ayuda a comprender los cambios en el estado de la enfermedad después de la terapia en el mismo animal.
Esto ayuda en aplicaciones terapéuticas secuenciales y de lapso de tiempo. Usando esta técnica, podemos evaluar la biología de la enfermedad y planificar un posible manejo posterior. Esto tiene implicaciones y oportunidades significativas en el descubrimiento de fármacos y nuevas terapias.
Los conceptos de resección estandarizada, un enfoque mínimamente invasivo y preservación automatizada de tejidos se pueden extender a otros tipos de tumores en diferentes sistemas de órganos, como tumores hepáticos y cánceres de cabeza y cuello. El protocolo es simple y el sistema es fácil de usar. Es mejor leer el protocolo publicado, que contiene todos los pasos necesarios y la solución de problemas.
Comience el experimento evaluando la sedación del ratón pellizcando el dedo del pie. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad de la córnea. A continuación, coloque el ratón en un marco estereotáctico.
Retire la grapa de la cirugía anterior y desinfecte la piel con ciclos alternos de un exfoliante a base de clorhexidina o betaína y alcohol. Luego cree una incisión longitudinal de un centímetro en la línea media a lo largo de la cicatriz quirúrgica anterior con un bisturí estéril. Acople la pieza de mano MIRS al brazo estereotáctico a través del adaptador de escenario.
Para configurar la máquina MIRS, inserte el cable de alimentación colocado en el panel posterior en el receptáculo del cable de alimentación. Encienda o apague el sistema alternando entre cero y uno. Inserte un extremo de la manguera de nitrógeno en el accesorio macho en el panel posterior de la consola.
Gire la tuerca de conexión en el sentido de las agujas del reloj para apretarla. Asegúrese de que la presión de suministro no exceda los 100 PSIG y conecte la manguera al suministro de nitrógeno. Selle la tapa del puerto de vacío para evitar fugas.
Compruebe que la perilla de aspiración en la parte frontal de la consola esté configurada en 100, que no haya fugas en el sistema de aspiración y que la presión de suministro de entrada de nitrógeno sea correcta. Inserte el conector gris del pedal en su receptáculo gris hasta que haga clic. Del mismo modo, inserte el conector azul de la pieza de mano en su receptáculo azul.
Prepare cada pieza de mano aspirando líquido estéril en la abertura a través del tubo y la pieza de mano y luego en el recipiente para garantizar que el interior del tubo y la pieza de mano estén lubricados. Seleccione el modo de aspiración en el panel frontal de la consola e inicie con el pedal. Inserte la cánula MIRS 23-G en el orificio de rebabas a una profundidad de 2,5 milímetros.
Inicie el proceso de resección presionando el pedal conectado a la cánula. Realice ciclos completos de resección utilizando la perilla de control de la pieza de mano. Después del proceso de resección, retire la cánula MIRS de calibre 23 y agregue cinco mililitros de 1X PBS para enjuagar el tubo y desalojar cualquier residuo residual.
Luego, cierre la herida con una grapadora y retire el mouse del marco estereotáctico. Devuelva el ratón a la almohadilla térmica para recuperarse de la anestesia antes de volver a colocarlo en su jaula. Después del experimento, purgue la cánula con medios refrigerados y aire para empujar todo el tejido resecado de vuelta al recipiente de recolección.
Retire el recipiente de recolección del sistema y coloque una tapa. A continuación, coloque la punta distal de la cánula en peróxido de hidrógeno al 3% y aplique succión para llenar la línea de succión de nuevo al recipiente de recolección de succión. Déjelo reposar durante 60 a 90 segundos y pulse intermitentemente aire y medios para enjuagarlo.
Sumerja la muestra del tumor en una placa de cultivo de tejido que contenga medio de lisis de glóbulos rojos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego coloque un filtro de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros y use un émbolo de jeringa para pasar la muestra del tumor a través del filtro. Con una pipeta de transferencia, utilice el medio RPMI 1640 para pasar las células y cualquier masa de tejido a través del filtro.
Centrifugar a 428 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada muestra en cinco mililitros de RPMI 1640 medio preparado. Coloque las muestras en una incubadora agitadora durante 20 minutos a 200 RPM a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, centrifugar las muestras a 428 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Filtre células individuales a través de un filtro celular de 70 micras y centrifugar a 274 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Realizar análisis de viabilidad celular con azul de tripano y un hemocitómetro.
La resección quirúrgica en ratones con MIRS causó una disminución significativa en la carga tumoral, como lo indica la reducción en la señal bioluminiscente basal media para grupos con carga tumoral grande y pequeña. En comparación con las imágenes de resonancia magnética previas a la resección de los tumores, la cavidad de resección se puede identificar en las exploraciones posteriores a la resección como un área hipointensa grande y redonda en el sitio de inoculación del tumor. En las secciones teñidas con H&E, se observó una cavidad de resección circular clara con un borde de productos sanguíneos, inflamación y células tumorales residuales.
El volumen de resección aumentó significativamente cuando se realizaron dos rotaciones de la abertura de corte, lo que permitió optimizar el volumen de resección según la carga tumoral. La comparación de la supervivencia en ratones con tumores no tratados versus ratones sometidos a resección de tumores por MIRS mostró un aumento en la supervivencia de 16 a 22 días en el grupo de tumores pequeños. Del mismo modo, en el grupo con una mayor carga tumoral, la mediana de supervivencia aumentó de 12 a 19 días.
Las imágenes de microscopía óptica de las muestras tomadas del sistema de preservación de tejidos aparecieron como células individuales con la presencia de unos pocos trozos pequeños de tejido en el día cero. Después de siete días, las células recolectadas con MIRS mostraron formación de neuroesferas en cultivos en suspensión, lo que indicó su potencial de iniciación tumoral. Es importante purgar y enjuagar el sistema de tuberías inmediatamente después del procedimiento para evitar una obstrucción del sistema.
Después de este procedimiento, se pueden utilizar estudios de eficacia de la terapéutica y estudios sobre marcadores diagnósticos y pronósticos en animales supervivientes después de la resección quirúrgica con el sistema de resección mínimamente invasivo.
