이것은 뇌종양 치료제에 대한 전임상 연구에서 매우 필요한 뇌종양 절제술 패러다임입니다. 최소 침습적 접근 방식을 통해 표준화된 절제가 가능하며 동시에 자동화된 조직 보존 시스템과도 결합됩니다. 이 프로토콜은 동물이 수술 후 생존 할 수있게하여 동일한 동물에서 치료 후 질병 상태의 변화를 이해하는 데 도움이됩니다.
이것은 순차적 및 시간 경과 치료 응용 프로그램에 도움이 됩니다. 이 기술을 사용하여 질병의 생물학을 평가하고 가능한 후속 관리를 계획 할 수 있습니다. 이는 약물 발견 및 새로운 치료법에 중요한 의미와 기회를 가지고 있습니다.
표준화 된 절제술, 최소 침습적 접근법 및 자동화 된 조직 보존의 개념은 간 종양 및 두 경부암과 같은 다른 장기 시스템의 다른 유형의 종양으로 확장 될 수 있습니다. 프로토콜은 간단하고 시스템은 사용자 친화적입니다. 필요한 모든 단계와 문제 해결이 포함 된 게시 된 프로토콜을 읽는 것이 가장 좋습니다.
발가락을 꼬집어 진정 작용에 대해 마우스를 평가하여 실험을 시작하십시오. 각막의 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 그런 다음 마우스를 입체 프레임에 놓습니다.
이전 수술에서 스테이플을 제거하고 클로르헥시딘 또는 베타인 기반 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 피부를 소독합니다. 그런 다음 멸균 메스를 사용하여 이전 수술 흉터를 따라 1cm 세로 정중선 절개를 만듭니다. MIRS 핸드피스를 스테이지 어댑터를 통해 스테레오택틱 암에 부착합니다.
MIRS 기기를 설정하려면 후면 패널에 설정된 전원 코드를 전원 코드 콘센트에 삽입합니다. 0과 1 사이를 전환하여 시스템 전원을 켜거나 끕니다. 질소 호스의 한쪽 끝을 콘솔 후면 패널의 수 피팅에 삽입합니다.
연결 너트를 시계 방향으로 돌려 조입니다. 공급 압력이 100 PSIG를 초과하지 않는지 확인하고 호스를 질소 공급 장치에 연결하십시오. 누출을 방지하기 위해 진공 포트의 뚜껑을 밀봉하십시오.
콘솔 전면의 흡인 손잡이가 100으로 설정되어 있는지, 흡인 시스템에 누출이 없는지, 질소 입력 공급 압력이 올바른지 확인하십시오. 딸깍 소리가 날 때까지 회색 풋 페달 커넥터를 회색 콘센트에 삽입합니다. 같은 방법으로 파란색 핸드피스 커넥터를 파란색 콘센트에 삽입합니다.
멸균 유체를 튜브와 핸드피스를 통해 조리개로 흡입한 다음 캐니스터로 흡입하여 각 핸드피스를 프라이밍하여 튜브와 핸드피스 내부가 윤활되도록 합니다. 콘솔 전면 패널에서 흡인 모드를 선택하고 풋 페달을 사용하여 시작합니다. 23-G MIRS 캐뉼러를 버 구멍에 2.5mm 깊이까지 삽입합니다.
캐뉼러에 연결된 풋 페달을 눌러 절제 과정을 시작하십시오. 핸드피스의 컨트롤 노브를 사용하여 전체 절제술을 수행합니다. 절제 과정 후 23게이지 MIRS 캐뉼러를 빼내고 1X PBS 5밀리리터를 추가하여 튜브를 세척하고 잔류 파편을 제거합니다.
그런 다음 스테이플러로 상처를 닫고 입체 프레임에서 마우스를 제거하십시오. 마우스를 케이지에 다시 넣기 전에 마취에서 회복하기 위해 가열 패드로 되돌립니다. 실험 후 식힌 배지와 공기로 캐뉼라를 퍼지하여 절제된 모든 조직을 수집 용기로 다시 밀어냅니다.
시스템에서 수집 캐니스터를 제거하고 캡을 놓으십시오. 다음으로 캐뉼라의 말단 팁을 3% 과산화수소에 넣고 흡입을 적용하여 흡입 라인을 흡입 수집 캐니스터에 다시 채웁니다. 60-90초 동안 그대로 두고 간헐적으로 공기와 매체를 펄스하여 플러시합니다.
종양 샘플을 RBC 용해 배지를 함유하는 조직 배양 접시에 실온에서 5분 동안 침지시킨다. 그런 다음 70 밀리리터 원추형 튜브에 50 미크론 필터를 놓고 주사기 플런저를 사용하여 종양 샘플을 필터를 통과시킵니다. 전사 피펫을 사용하여 RPMI 1640 배지를 사용하여 세포와 조직 덩어리를 필터를 통과시킵니다.
섭씨 4도에서 5 분 동안 G 428 배로 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 준비된 RPMI 1640 배지 5ml에 각 샘플을 재현탁합니다. 샘플을 셰이커 인큐베이터에 섭씨 37도에서 200RPM으로 20분 동안 넣습니다.
배양 후, 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 428배 G로 원심분리하고 상청액을 버린다. 70미크론 세포 여과기를 통해 단일 세포를 여과하고 섭씨 4도에서 3분 동안 274배 G로 원심분리합니다. 트리판 블루와 혈구계로 세포 생존율 분석을 수행합니다.
MIRS를 사용하는 마우스에서의 외과적 절제는 크고 작은 종양 부담 둘 다를 갖는 그룹에 대한 평균 기준선 생체발광 신호의 감소에 의해 나타난 바와 같이 종양 부담의 유의한 감소를 야기하였다. 종양의 절제전 MRI 이미지와 비교하여 절제술 구멍은 절제 후 스캔에서 종양 접종 부위의 크고 둥근 저강도 영역으로 식별할 수 있습니다. H & E 염색 된 절편에서, 혈액 제제, 염증 및 잔류 종양 세포의 테두리가있는 명확한 원형 절제 공동이 관찰되었다.
절단 개구를 두 번 회전했을 때 절제량이 크게 증가하여 종양 부담에 따라 절제량을 최적화할 수 있었습니다. 미처리 종양이 있는 마우스와 MIRS에 의한 종양 절제술을 받은 마우스에서의 생존율의 비교는 작은 종양 그룹에서 16일에서 22일째까지 생존율의 증가를 보여주었다. 유사하게, 종양 부담이 큰 그룹에서 생존 중앙값은 12일에서 19일로 증가했습니다.
조직 보존 시스템에서 채취한 샘플의 광학 현미경 이미지는 0일째에 몇 개의 작은 조직 덩어리가 존재하는 단일 세포로 나타났습니다. 7일 후, MIRS로 수확된 세포는 현탁 배양에서 신경권 형성을 나타냈고, 이는 그들의 종양 개시 가능성을 나타냈다. 시스템이 막히지 않도록 절차 직후 튜브 시스템을 퍼지하고 세척하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 최소 침습 절제 시스템으로 외과적 절제 후 생존 동물에게 치료제의 효능 연구와 진단 및 예후 마커에 대한 연구를 사용할 수 있습니다.
