Questo è un paradigma di resezione del tumore cerebrale che è altamente necessario nella ricerca preclinica sulle terapie per i tumori cerebrali. Consente una resezione standardizzata attraverso un approccio minimamente invasivo, mentre allo stesso tempo è anche accoppiato a un sistema automatizzato di conservazione dei tessuti. Questo protocollo consente all'animale di sopravvivere dopo l'intervento chirurgico e, quindi, aiuta a comprendere i cambiamenti nello stato della malattia dopo la terapia nello stesso animale.
Questo aiuta nelle applicazioni terapeutiche sequenziali e time-lapse. Utilizzando questa tecnica, possiamo valutare la biologia della malattia e pianificare una possibile gestione successiva. Ciò ha implicazioni e opportunità significative nella scoperta di farmaci e nuove terapie.
I concetti di resezione standardizzata, un approccio minimamente invasivo e la conservazione automatizzata dei tessuti possono essere estesi ad altri tipi di tumori in diversi sistemi di organi, come i tumori del fegato e i tumori della testa e del collo. Il protocollo è semplice e il sistema è facile da usare. È meglio leggere il protocollo pubblicato, che contiene tutti i passaggi necessari e la risoluzione dei problemi.
Inizia l'esperimento valutando il topo per la sedazione pizzicando la punta. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare la secchezza della cornea. Quindi, posizionare il mouse su una cornice stereotassica.
Rimuovere il fiocco dal precedente intervento chirurgico e disinfettare la pelle con cicli alternati di uno scrub a base di clorexidina o betaina e alcool. Quindi creare un'incisione longitudinale della linea mediana di un centimetro lungo la precedente cicatrice chirurgica usando un bisturi sterile. Collegare il manipolo MIRS al braccio stereotassico tramite l'adattatore di scena.
Per configurare la macchina MIRS, inserire il cavo di alimentazione impostato sul pannello posteriore nella presa del cavo di alimentazione. Accendere o spegnere il sistema alternando tra zero e uno. Inserire un'estremità del tubo dell'azoto nel raccordo maschio sul pannello posteriore della console.
Ruotare il dado di connessione in senso orario per stringerlo. Assicurarsi che la pressione di alimentazione non superi i 100 PSIG e collegare il tubo all'alimentazione di azoto. Sigillare il coperchio della porta del vuoto per evitare perdite.
Verificare che la manopola di aspirazione sulla parte anteriore della console sia impostata su 100, che non vi siano perdite nel sistema di aspirazione e che la pressione di alimentazione dell'azoto in ingresso sia corretta. Inserire il connettore grigio del pedale nella presa grigia finché non scatta. Allo stesso modo, inserire il connettore del manipolo blu nella sua presa blu.
Innescare ogni manipolo aspirando il fluido sterile nell'apertura attraverso il tubo e il manipolo e quindi nel contenitore per garantire che l'interno del tubo e del manipolo sia lubrificato. Selezionare la modalità di aspirazione sul pannello frontale della console e avviare utilizzando il pedale. Inserire la cannula MIRS 23-G nel foro di bava fino a una profondità di 2,5 millimetri.
Avviare il processo di resezione premendo il pedale collegato alla cannula. Eseguire cicli completi di resezione utilizzando la manopola di controllo nel manipolo. Dopo il processo di resezione, prelevare la cannula MIRS calibro 23 e aggiungere cinque millilitri di PBS 1X per lavare il tubo e rimuovere eventuali detriti residui.
Quindi, chiudere la ferita con una cucitrice e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Riportare il mouse sulla piastra riscaldante per riprendersi dall'anestesia prima di rimetterlo nella sua gabbia. Dopo l'esperimento, spurgare la cannula con mezzi refrigerati e aria per spingere tutto il tessuto resecato nel contenitore di raccolta.
Rimuovere il contenitore di raccolta dal sistema e posizionare un tappo. Quindi, posizionare la punta distale della cannula in perossido di idrogeno al 3% e applicare l'aspirazione per riempire la linea di aspirazione al contenitore di raccolta dell'aspirazione. Lasciare riposare per 60-90 secondi e pulsare a intermittenza aria e mezzi per sciacquarlo.
Immergere il campione tumorale in un piatto di coltura tissutale contenente terreno di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi posizionare un filtro da 70 micron su un tubo conico da 50 millilitri e utilizzare uno stantuffo della siringa per far passare il campione tumorale attraverso il filtro. Con una pipetta di trasferimento, utilizzare il supporto RPMI 1640 per far passare le cellule e qualsiasi massa tissutale attraverso il filtro.
Centrifugare a 428 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere ogni campione in cinque millilitri di terreno RPMI 1640 preparato. Posizionare i campioni in un incubatore shaker per 20 minuti a 200 RPM a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 428 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Filtrare le singole celle attraverso un filtro a celle da 70 micron e centrifugare a 274 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Condurre analisi di vitalità cellulare con tripano blu e un emocitometro.
La resezione chirurgica nei topi che utilizzavano MIRS ha causato una significativa diminuzione del carico tumorale, come indicato dalla riduzione del segnale bioluminescente basale medio per i gruppi con carico tumorale sia grande che piccolo. Rispetto alle immagini MRI pre-resezione dei tumori, la cavità di resezione può essere identificata sulle scansioni post-resezione come una grande area ipointensa rotonda nel sito di inoculazione del tumore. Nelle sezioni colorate con H & E, è stata osservata una cavità di resezione circolare chiara con un bordo di prodotti ematici, infiammazione e cellule tumorali residue.
Il volume di resezione è aumentato significativamente quando sono state eseguite due rotazioni dell'apertura di taglio, che hanno permesso l'ottimizzazione del volume di resezione in base al carico tumorale. Il confronto della sopravvivenza nei topi con tumori non trattati rispetto ai topi sottoposti a resezione dei tumori da parte di MIRS ha mostrato un aumento della sopravvivenza da 16 a 22 giorni nel piccolo gruppo tumorale. Allo stesso modo, nel gruppo con un carico tumorale maggiore, la sopravvivenza mediana è aumentata da 12 a 19 giorni.
Le immagini al microscopio ottico dei campioni prelevati dal sistema di conservazione dei tessuti sono apparse come singole cellule con la presenza di alcuni piccoli pezzi di tessuto al giorno zero. Dopo sette giorni, le cellule raccolte con MIRS hanno mostrato la formazione della neurosfera in colture in sospensione, che indicavano il loro potenziale di inizio del tumore. È importante eliminare e lavare il sistema di tubi subito dopo la procedura per evitare di intasare il sistema.
A seguito di questa procedura, studi di efficacia delle terapie e studi sui marcatori diagnostici e prognostici possono essere utilizzati su animali sopravvissuti dopo resezione chirurgica con il sistema di resezione minimamente invasivo.
