Nuestra capacidad para predecir con precisión cómo responden los humanos a los medicamentos durante los ensayos clínicos es limitada debido a la falta de modelos preclínicos fisiológicamente relevantes. Este sistema microfisiológico puede abordar esa disparidad. Este sistema derivado de células humanas imita con precisión toda la naturaleza de la enfermedad articular de la osteoartritis en la rodilla humana, lo que permite la prueba de medicamentos modificadores de la osteoartritis antes de los ensayos clínicos, lo que podría ahorrar millones de dólares.
Comience a preparar gelatina metacrilatada, o GelMA, agregando 17 gramos de gelatina tipo B a 500 mililitros de agua destilada. Mezclar durante 30 minutos en una coctelera a 37 grados centígrados y añadir 13 mililitros de anhídrido metacrílico antes de mezclar durante la noche en una coctelera. Al día siguiente, prepare alrededor de 60 mililitros de alícuotas del GelMA en bolsas de diálisis.
Coloque todas las bolsas de diálisis en agua destilada con una barra de agitación durante siete días. Cambie el agua varias veces al día y deje las bolsas a cuatro grados centígrados durante la noche. El día siete, vierta el GelMA en un plato y congélelo a menos 80 grados centígrados antes de la liofilización.
Luego, liofilizar el GelMA colocándolo en la cámara de vacío de un liofilizador. Asegúrese de que se seque completamente antes de retirarlo del liofilizador. A continuación, disuelva el GelMA liofilizado en la solución salina equilibrada de Hanks a una concentración del 15% y ajuste el pH a 7,4 utilizando una pequeña cantidad de hidróxido de sodio.
Según el volumen adquirido, complemente la solución con antibiótico antimicótico y fosfinato de fenilo de litio al 0,15%, o LAP. Proteja la solución GelMA de la luz y guárdela a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. Autoclave impreso en 3D cámaras de biorreactor de doble flujo, tapas e insertos en bolsas de autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos con vapor.
Y luego, durante 20 minutos con calor seco. Después de la esterilización, remoje las cámaras, tapas e insertos del biorreactor en 15 mililitros de PBS estéril durante la noche dentro del gabinete de bioseguridad, seguido de un secado completo. Usando una pipeta de 1000 microlitros, resuspender 20 veces 10 a la sexta célula madre mesenquimal derivada de médula ósea humana, o MSC, por mililitro de células en una solución de GelMA al 15%.
Luego, presione un molde de silicona estéril y seco contra una placa de Petri, usando guantes estériles. Coloque un inserto en cada orificio del molde de silicona con pinzas con el lado del orificio del inserto hacia abajo. Una vez hecho esto, agregue alrededor de 50 microlitros de la suspensión celular por inserto usando una pipeta de 200 microlitros.
Entrecruza el gel dentro del inserto exponiendo la parte superior a una linterna UV de longitud de onda de 395 nanómetros durante 1,5 minutos, luego iluminando el otro lado durante 30 segundos. Con pinzas estériles, transfiera inmediatamente los insertos a ocho mililitros de medio de crecimiento en una placa de seis pocillos sin cultivo tisular y permita que las células se recuperen durante la noche. Para iniciar la diferenciación del tejido adiposo, transfiera los insertos a ocho mililitros de medio adipogénico y críquelos durante 28 días con cambio diario de medio.
Para diseñar las unidades osteocondral, coloque los insertos en cámaras de biorreactores de doble flujo, tape los pozos e infunda las dos corrientes por separado a una velocidad de flujo de cinco microlitros por minuto con 35 mililitros de medio osteogénico y 35 mililitros de medio condrogénico. Mantener las células para la diferenciación durante 28 días mediante la realización de cambios quincenales de jeringa con los respectivos tipos de medios. Para derivar los fibroblastos, diferenciar las MSCs en cultivo 2D en un matraz de cultivo celular tisular T de 150 centímetros cuadrados que contenga 20 mililitros de medio fibrogénico durante 21 días.
Mantener el cambio semanal del medio. Después de 21 días, use cuatro mililitros de tripsina para desprender las células. Encapsula los geles 3D dentro de los insertos.
Para obtener tejido fibroso similar a la sinovial, o SFT, siga un protocolo similar. Conecte el tubo de silicona, que tiene un diámetro interior de 0,062 pulgadas y un diámetro exterior de 0,125 pulgadas, a la barra del biorreactor miniconjunto en un extremo y a los conectores de bloqueo de señuelo F 1/16 en el otro extremo. Luego, autoclave los biorreactores 3D minijoint junto con el tubo de silicona y las tapas.
Preparar y cargar 35 mililitros de medio para ser utilizados para el cultivo de minijuntas en los reservorios medianos. Utilice pinzas rectas para transferir las unidades osteocondrales del biorreactor de doble flujo al pocillo derecho del biorreactor miniarticular. Transfiera el inserto de tejido adiposo y el inserto de tejido fibroso a los pocillos izquierdo y medio, respectivamente, antes de cubrir todos los pocillos con tapas esterilizadas.
Conecte las entradas de clip minijoint a los depósitos medianos y las salidas a las jeringas. Luego, monte las jeringas en una bomba de jeringa. Transfiera la bomba y las virutas a una incubadora.
Coloque los depósitos medianos en hielo fuera de la incubadora. Accione la bomba en el modo de extracción, extrayendo el medio del depósito del medio a la cámara del biorreactor miniconjunto. Continúe este proceso de cultivo de miniarticulaciones durante 28 días.
Para modelar la inflamación articular y la degeneración del cartílago, agregue interleucina una beta a la cepa media fibrogénica a 10 nanogramos por mililitro durante siete días. Asegúrese de reemplazar la jeringa al tercer día antes de proporcionar interleucina fresca una beta al medio fibrogénico. Para la prueba de drogas, después de tres días de tratamiento con interleucina una beta, administre el medicamento en el medio compartido, simulando una administración intraarticular, o en todos los tipos de medios, simulando una administración sistémica.
Después de siete días de tratamiento con interleucina una beta, recolecte tejidos individuales para el análisis. Después de retirar los insertos con pinzas estériles, empuje un punzón de biopsia a través del centro del inserto para extraer el gel y colocar el gel en PBS. A continuación, corte los geles osteocondrales por la mitad mientras evalúa la expresión génica.
Recoja y centrifuga alrededor de 1,5 mililitros de medios de cada fuente de medio a 14.000 G durante 10 minutos. Después de desechar el sedimento, congele rápidamente los medios acondicionados en nitrógeno líquido. Para la tinción histológica y la inmunotinción, primero, fije las muestras de tejido fibroso osteocondral y sinovial, o SFT, en formalina tamponada al 10% y deshidratarlas en etanol de concentraciones ascendentes.
Limpie la muestra en xileno, insértela en parafina y, finalmente, divida las muestras en seis micrómetros de espesor. En el caso del tejido adiposo, teñir las muestras formales y fijas tamponadas al 10% directamente, con solución de O rojo aceite o BODIPY. Los fenotipos específicos del tejido se mantuvieron bien para los microtejidos individuales.
Se recogieron todos los tejidos de la miniarticulación para analizar sus fenotipos después de 28 días de cultivo. El componente óseo de los microtejidos de las unidades osteocondrales expresó altos niveles de osteocalcina. En la porción de cartílago del osteocondral, los tejidos expresaron niveles significativamente altos de colágeno tipo dos y agrecano.
Los niveles de expresión de genes adipogénicos representativos, adiponectina y leptina fueron mayores en el tejido adiposo. La deposición de minerales de calcio, fosfatasa alcalina y proteína osteocalcina se observó principalmente en el tamaño óseo de los microtejidos osteocondral. El lado del cartílago de los tejidos osteocondrales mostró glicosaminoglicanos y colágeno tipo dos bien retenidos.
La expresión de marcadores asociados a la hipertrofia de condrocitos, colágeno tipo 10 y erizo indio, se redujo significativamente después de 28 días de cultivo. Se encontró abundante depósito de gotas de lípidos en el tejido adiposo. La tinción inmunofluorescente mostró una robusta expresión de lubricina y cadherina 11 por el SFT después de cuatro semanas de cultivo.
En un modelo de enfermedad, IL un tratamiento beta resultó en apoptosis celular y niveles elevados de MMP-13 en el SFT. La degradación del cartílago fue tratada por IL una beta, lo que sugiere la aparición de diafonía entre los tejidos osteocondrales y SFT. La eficacia terapéutica del naproxeno mediante administración sistémica mostró una reducción de la degradación del cartílago en IL una miniarticulación beta.
La PCR en tiempo real indicó que los cuatro posibles fármacos modificadores de la enfermedad para la osteoartritis revirtieron parcialmente la pérdida de cartílago. Los pasos más importantes de este procedimiento incluyen la reticulación de los geles en los insertos y la colocación del inserto en el biorreactor. El chip permite investigar la contribución de otros factores de riesgo ofrecidos en la artrosis, como la obesidad y las lesiones mecánicas.
También se puede utilizar para estudiar otras enfermedades articulares.
