El objetivo general de este protocolo es describir la fabricación de dispositivos microfluídicos astillados de órganos para recapitular la funcionalidad a nivel de órgano in vitro. Este protocolo describe una manera de fabricar dispositivos de organización astillados recapitulando la función a nivel de órgano in vitro. El func, los dispositivos, como estos, en realidad se fabrican utilizando moldes impresos en 3D de una goma de silicio suave.
Este caucho nos permite realmente impregnar estos dispositivos con señales mecánicas que nos permite estirar el tejido como se puede entrar digamos un pulmón o un intestino. También añadimos profusión, que imita el flujo sanguíneo y el flujo de otros fluidos corporales dentro de los sistemas de órganos. Ahora, juntos, estos dispositivos nos permiten recrear y tratar de entender la compleja fisiología que sucede in vivo.
Pero haz esto in vitro. Así que esencialmente estamos experimentando con humanos, pero no con personas. Y por lo tanto es una manera muy eficaz de salvar la brecha entre los estudios en animales, que siempre se hacen en el desarrollo preclínica de la terapia, y luego antes de los estudios en humanos, que se llaman ensayos clínicos, donde hay un riesgo mucho mayor para el ser humano, para la seguridad humana.
Así que estos dispositivos ayudan a salvar la brecha y realmente nos permiten desarrollar nuevas terapias y entender la biología básica que realmente sucede en sistemas complejos como el humano. Preparación del canal superior. Limpie el lado brillante de cada pieza de poliuretano con etanol y toallitas limpias.
Coloque el lado brillante del poliuretano sobre el lado abierto del molde en su lugar. Coloque los conjuntos de molde y poliuretano en la plantilla, el lado texturizado contra el extremo de la plantilla. Continúe haciendo esto hasta que todos los moldes se hayan colocado dentro de la plantilla.
Apriete la plantilla girando su asa con una llave, hasta que el espaciado de la plantilla sea de 25 milímetros de ancho. Hacer un barco de papel de aluminio que rodea el molde en su lugar plantilla. Vierta PDMS en el pozo de cada molde hasta que esté lleno.
Una vez que se llene toda la plantilla, coloque la plantilla en el desecador de vacío. Después de una hora, retirar del desecador. Y colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos cuatro horas.
Desmontar la plantilla con una llave inglesa. Retire las tiras de poliuretano de cada molde. Y desechar.
Desmoldar cuidadosamente las piezas DE PDMS de sus moldes y ponerlas de lado hacia arriba. Alinee la hoja del rascador de azulejos en la muesca de la pestaña final. Y corte cada extremo para cingular los componentes superiores.
Almacene las piezas terminadas en platos cuadrados de Petri. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente. Preparación del canal inferior.
Vierta 10,5 gramos de PDMS en el molde. La pistola de aire se puede utilizar muy suavemente para mover el PDMS sobre el espacio. Coloque los moldes en el desecador de vacío.
Después de una hora, mueva los moldes a un horno centígrado de nivel 60 grados. Coloque el molde sobre la mesa en una campana de flujo laminar. Afloje el PDMS del borde del molde.
Agarre una esquina y despegue suavemente los PDMS de la superficie del molde. Cuando se retire por completo, invierta y acuda en la superficie de trabajo para que las entidades de canal estén boca arriba. Corte a lo largo de los bordes exteriores con cortador de baldosas.
Con fórceps de paleta plana, las piezas la puestas se presentan en la cinta para eliminar los desechos. Retire la pieza de la cinta de embalaje. Arrastre el extremo suelto de la pieza a través de la diapositiva.
El cabo suelto se laminará con el vidrio. Características de la cubierta con cinta escocesa. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente.
Preparación de membranas PDMS. Compruebe que las obleas están libres de PDMS en la parte posterior. Coloque cada oblea de membrana en las ranuras designadas.
Utilice la jeringa de un ml para colocar 09 ml de PDMS en el centro de cada matriz de poste de obleas de membrana. Deje que PDMS se siente durante un mínimo de cinco minutos. Permita que PDMS se propague por todo el poste de la oblea de membrana.
No continúe con el paso siguiente hasta que al menos el 75% de la matriz de mensajes esté cubierta por PDMS. El plasma trata la tira de policarbonato siguiendo las condiciones descritas en el protocolo. Retire la lámina de policarbonato de la máquina de plasma y utilice tijeras para cortar las láminas de policarbonato en cuadrados de 45 milímetros por 45 milímetros.
Coloca el lado tratado con plasma de los cuadrados de policarbonato sobre el PDMS, centrado en la oblea de membrana. Coloque el espaciador PDMS en el centro del cuadrado de policarbonato. A continuación, coloque el policarbonato texturizado precortado.
Inserte las bandejas de modo que la bandeja tres esté en la parte posterior, la bandeja dos está en el centro y la bandeja uno está en la parte delantera. La bandeja uno tiene una muesca para la alineación. Abra la válvula de presión de salida y abra muy lentamente la válvula de presión de entrada.
Esto es para que los cuatro kilogramos de fuerza se apliquen gradualmente a cada oblea de membrana, a diferencia de instantáneamente que puede romper las obleas. Gire el interruptor AMF para iniciar el ciclo de curado. A continuación, cierre la válvula de presión de entrada y abra las válvulas de presión de salida para liberar la presión de los cilindros de aire.
Retire las bandejas y lléelas a la campana de flujo laminar. Pelar cuidadosamente el policarbonato texturizado. Retire con cuidado el espaciador PDMS.
Inspeccione la membrana PDMS en busca de áreas con orificios pasantes. Utilice un marcador para trazar el contorno del área de taladro pasante. También marque cualquier agujero o defecto en las membranas.
Este es un ejemplo de una membrana sin marcar y marcada. Con pinzas de manipulación de obleas, afloje las obleas de la bandeja. Retire cada membrana de la oblea y colóquela en la placa De Petri.
La membrana PDMS se desmoldeará de la oblea y se unirá al respaldo de policarbonato. Almacene las piezas en gabinetes de presión positiva a temperatura ambiente. Montaje y preparación superior.
Con cinta escocesa con acabado mate, limpie las membranas PDMS, así como el interior de la placa Petri para eliminar los residuos. Pegue a fondo el lado de la entidad de cada parte superior de cada canal alto para eliminar los desechos. Coloque las tapas en el plato Petri con membrana PDMS.
Tenga en cuenta que algunas membranas pueden tomar una o dos partes superiores. Los canales principales de cada parte superior deben caber dentro del área marcada dentro de la membrana. Cargue los platos de Petri en el plasma.
Plasma tratar la membrana y la parte superior de acuerdo con el protocolo escrito. Una vez finalizado el ciclo de unión, retire los platos y colóquelos en la membrana. Colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos dos horas.
Usando un bisturí, trace alrededor del perímetro de la parte superior unida para separarlo del portador de policarbonato. Una vez trazada la pieza, pele la parte superior del policarbonato. La membrana PDMS que se ha unido a la parte superior debe pelar del portador también.
El uso de pinzas elimina la membrana de los puertos que acceden al canal inferior. No deje ninguna parte de la membrana que cubra el puerto de acceso. Además, retire los restos o el polvo con pinzas.
Montaje de virutas. Lado de la característica hacia arriba, plasma tratar los conjuntos superiores con los fondos. Bajo un microscopio invertido, alinee el conjunto superior con la mitad inferior.
Colocar en horno centígrado de 60 grados durante al menos dos horas. Resultados. El protocolo presentado aquí describe la fabricación escalable de los chips de órganos PDMS. Estos dispositivos permiten el cultivo de dos tipos distintos de tejidos profusos en una membrana porosa elástica.
Los canales PDMS se convierten utilizando moldes impresos en 3D, lo que acelera la creación de prototipos de nuevos diseños. Los canales superiores se funden en moldes bajo compresión contra una junta de poliuretano compatible para producir componentes con puertos moldeados. Mientras que los componentes del canal inferior se funden en bandejas y se manejan en el respaldo de la diapositiva del microscopio.
Este enfoque de fabricación combina el patrón multiescala de las piezas en un solo paso, lo que ahorra tiempo, mejora la reproducibilidad y la trazabilidad, y reduce los residuos generados por el punzonado por puerto y múltiples pasos de corte. Las membranas porosas son fundamentales para la función del chip de órgano, y el enfoque de fabricación basado en la fundición contra obleas de silicio patrón resulta en membranas de espesor consistente y acabado superficial. La manipulación mediante soportes de policarbonato permite una mayor producción y almacenamiento de lotes.
El chip de órgano montado consta de dos canales de profusión en un paquete ópticamente transparente. En la región superpuesta, una membrana porosa PDMS permite la interacción tejido-tejido de metabolitos, proteínas, terapias, patógenos y células para recapitular la función de la viruta del órgano, mientras que dos canales paralelos a ambos lados se utilizan para proporcionar tensión mecánica, utilizando la acción de vacío cíclico. La porosidad de la membrana PDMS apoya biomédricamente el flujo de metabolitos, factores de crecimiento e incluso células entre la vasculatura y el parénquima de órganos.
La permeabilidad aparente de la membrana se determinó utilizando la di-concentración en los canales de salida con y sin células intestinales Caco-2. Las capas de células de la viruta intestinal proporcionan una barrera significativamente mayor a la permeabilidad. El chip de órgano se puede accionar utilizando los canales de vacío paralelos para aplicar cuantitativa y reproduciblemente la carga de cepa cíclica a la membrana y, por lo tanto, los tejidos cultivados.
Esta cepa cíclica combinada con la profusión de medios apoya la diferenciación celular para imitar mejor la fisiología del órgano in vivo, como la formación de vellosidades en el chip intestinal. Usando el protocolo descrito aquí, ahora debería ser capaz de fabricar un chip de órgano PDMS elástico.
