创建膝关节芯片，用于关节疾病建模和药物测试

由于缺乏生理相关的临床前模型，我们在临床试验期间准确预测人类对药物反应的能力受到限制。这种微生理系统可以解决这种差异。这种人类细胞衍生系统准确地模拟了人类膝关节骨关节炎的整个关节疾病性质，允许在临床试验之前测试疾病修饰骨关节炎药物，可能节省数百万美元。

开始制备甲基丙烯酸化明胶或GelMA，将17克B型明胶添加到500毫升蒸馏水中。在37摄氏度的摇床上混合30分钟，加入13毫升甲基丙烯酸酐，然后在摇床上混合过夜。第二天，将大约 60 毫升的 GelMA 等分试样放入透析袋中。

将所有透析袋放入带搅拌棒的蒸馏水中七天。每天多次换水，并将袋子放在四摄氏度下过夜。在第 7 天，将 GelMA 倒入培养皿中，并在冻干前将其冷冻在零下 80 摄氏度。

然后，通过将GelMA置于冻干机的真空室中来冻干。在从冻干机中取出之前，请确保完全干燥。接下来，将冻干的GelMA溶解在15%浓度的Hanks平衡盐溶液中，并使用少量氢氧化钠将pH调节至7.4。

根据获得的体积，用抗生素抗真菌剂和0.15%苯基次膦酸锂或LAP补充溶液。保护GelMA溶液免受光照，并将其储存在零下20摄氏度，直到进一步使用。高压灭菌器3D打印的双流生物反应器室，盖子和插入物在121摄氏度的高压灭菌袋中，用蒸汽加热20分钟。

然后，用干热20分钟。灭菌后，将生物反应器室，盖子和插入物浸泡在生物安全柜内的15毫升无菌PBS中过夜，然后完全干燥。使用1000微升移液器，将每毫升细胞重悬20次10至第六个人骨髓来源的间充质干细胞或MSCs，在15%GelMA溶液中。

然后，使用无菌手套将无菌干燥的硅胶模具压在培养皿上。用镊子将一个嵌件放入硅胶模具的每个孔中，将嵌件的孔侧朝下。完成后，使用200微升移液器在每个插入物中加入约50微升细胞悬液。

通过将顶部暴露在 395 纳米波长的紫外线手电筒下 1.5 分钟，然后照亮另一侧 30 秒，将插入物内的凝胶交联。使用无菌镊子，立即将插入物转移到非组织培养六孔板中的8毫升生长培养基中，并使细胞在夜间恢复。为了开始脂肪组织的分化，将插入物转移到8毫升的成脂培养基中，并每天更换培养基28天。

为了设计骨软骨单元，将插入物放入双流生物反应器室中，盖上孔盖，并以每分钟5微升的流速分别注入35毫升成骨培养基和35毫升成骨培养基。通过对相应的培养基类型进行每两周一次的注射器更换，将细胞维持分化28天。为了获得成纤维细胞，在含有20毫升纤维化培养基的T 150平方厘米组织细胞培养瓶中分化2D培养中的MSCs，持续21天。

保持媒体的每周更换。21天后，使用四毫升胰蛋白酶分离细胞。将3D凝胶封装在插入物中。

要获得滑膜样纤维组织或SFT，请遵循类似的方案。将内径为0.062英寸和外径为0.125英寸的硅胶管连接到一端的微型接头生物反应器杆和另一端的F 1/16诱饵锁连接器。然后，将3D微型接头生物反应器以及硅胶管和盖子高压灭菌。

准备35毫升用于微型接头培养的培养基并将其装入培养基储液槽中。使用直镊子将骨软骨单元从双流生物反应器转移到微型关节生物反应器的右孔中。将脂肪组织插入物和纤维组织插入物分别转移到左孔和中间孔中，然后用灭菌盖覆盖所有孔。

将微型接头夹入口连接到介质储液罐，将出口连接到注射器。然后，将注射器安装到注射泵上。将泵和薯片转移到培养箱中。

将培养基储液槽放在培养箱外的冰上。以抽出模式操作泵，将介质从介质储液器吸入微型联合生物反应器室。继续这种微型关节培养过程28天。

为了模拟关节炎症和软骨变性，以每毫升10纳克的速度将白细胞介素一个β添加到纤维化培养基菌株中，持续7天。确保在第三天更换注射器，然后再向纤维化培养基提供新鲜的白细胞介素一个β。对于药物测试，在白细胞介素一次β治疗三天后，在共享培养基中给药，模拟关节内给药，或在所有培养基类型中模拟全身给药。

白介素一次β治疗七天后，收集单个组织进行分析。使用无菌镊子取出插入物后，将活检冲头推入插入物的中心以取出凝胶并将凝胶放入PBS中。接下来，在评估基因表达的同时将骨软骨凝胶切成两半。

从每个培养基源收集约1.5毫升培养基，以14， 000 G离心10分钟。丢弃沉淀物后，将调节介质快速冷冻在液氮中。对于组织学染色和免疫染色，首先，将骨软骨和滑膜样纤维组织或SFT样品固定在10%缓冲的福尔马林中，并在升序浓度的乙醇中脱水。

在二甲苯中清除样品，将它们嵌入石蜡中，最后将样品切成六微米厚的厚度。对于脂肪组织，用油红O溶液或BODIPY直接染色10%缓冲的正式和固定样品。单个微组织的组织特异性表型保持良好。

在培养28天后收集微型关节的所有组织以分析其表型。骨软骨单位微组织的骨成分表达高水平的骨钙素。在骨软骨的软骨部分，组织表达明显高水平的二型胶原和聚集胶。

代表性脂肪基因脂联素和瘦素在脂肪组织中的表达水平较高。钙矿物质、碱性磷酸酶和骨钙素蛋白的沉积主要见于骨软骨微组织的骨骼大小。骨软骨组织的软骨侧显示出良好的糖胺聚糖和二型胶原蛋白保留。

培养28天后，软骨细胞肥大相关标志物10型胶原和印度刺猬的表达显着下调。在脂肪组织中发现丰富的脂滴沉积。免疫荧光染色显示，经过4周的培养，SFT对润滑素和钙粘蛋白11的表达非常稳定。

在疾病模型中，IL one β处理导致SFT中的细胞凋亡和MMP-13水平升高。软骨降解用IL one β处理，提示骨软骨组织和SFT之间发生串扰。萘普生全身给药的治疗效果显示IL one β微型关节软骨降解减少。

实时荧光定量PCR表明，四种潜在的疾病修饰骨关节炎药物部分逆转了软骨损失。该过程最重要的步骤包括插入物中凝胶的交联和插入物放入生物反应器中。该芯片允许调查骨关节炎中提供的其他风险因素的贡献，例如肥胖和机械损伤。

它也可以用来研究其他关节疾病。