임상 시험 중에 인간이 약물에 어떻게 반응하는지 정확하게 예측하는 우리의 능력은 생리학적으로 관련된 전임상 모델이 없기 때문에 제한적입니다. 이 미세 생리학적 시스템은 이러한 불균형을 해결할 수 있습니다. 이 인간 세포 유래 시스템은 인간 무릎의 골관절염의 전체 관절 질환 특성을 정확하게 모방하여 임상 시험 전에 골관절염 약물을 수정하는 질병을 테스트 할 수 있으므로 잠재적으로 수백만 달러를 절약 할 수 있습니다.
500 밀리리터의 증류수에 17 그램의 젤라틴 B 형을 첨가하여 메타 크릴 레이트 젤라틴 또는 GelMA를 준비하십시오. 섭씨 37도의 셰이커에서 30분 동안 혼합하고 셰이커에서 밤새 혼합하기 전에 13밀리리터의 메타크릴산 무수물을 첨가합니다. 다음날, 약 60 밀리리터의 GelMA 분취량을 투석 백에 준비하십시오.
모든 투석 백을 증류수에 넣고 젓는 막대로 7 일 동안 두십시오. 하루에 여러 번 물을 갈아주고 밤새 가방을 섭씨 4도에 두십시오. 7일째 되는 날, GelMA를 접시에 붓고 동결건조 전에 섭씨 영하 80도에서 얼립니다.
그런 다음 GelMA를 동결건조기의 진공 챔버에 넣어 동결건조합니다. 동결건조기에서 제거하기 전에 완전한 건조를 보장합니다. 다음으로, 동결건조된 GelMA를 15% 농도의 행크스 평형 염 용액에 녹이고 소량의 수산화나트륨을 이용하여 pH를 7.4로 조절한다.
획득 한 부피에 따라 항생제 항진균제와 0.15 % 리튬 페닐 포스 피 네이트 (LAP)로 용액을 보충하십시오. GelMA 용액을 빛으로부터 보호하고 더 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 오토클레이브를 3D 프린팅한 이중 흐름 바이오리액터 챔버, 뚜껑 및 인서트를 오토클레이브 백에 넣고 섭씨 121도에서 증기로 20분 동안 측정합니다.
그런 다음 건조한 열로 20 분 동안. 멸균 후, 생물 반응기 챔버, 뚜껑 및 삽입물을 15 밀리리터의 멸균 PBS에 하룻밤 동안 생물 안전 캐비닛 내부에 담근 다음, 완전히 건조시킨다. 1000 마이크로리터 피펫을 사용하여 15% GelMA 용액에서 밀리리터당 6번째 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 20회 10배로 재현탁합니다.
그런 다음 멸균 장갑을 사용하여 멸균 건조 실리콘 몰드를 페트리 접시에 대고 누릅니다. 인서트의 구멍 면이 아래를 향하도록 집게를 사용하여 실리콘 몰드의 각 구멍에 인서트를 하나씩 넣습니다. 완료되면 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 삽입 당 약 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 추가합니다.
상단을 395나노미터 파장의 UV 손전등에 1.5분 동안 노출시킨 다음 다른 면을 30초 동안 비추어 삽입물 내부의 젤을 가교합니다. 멸균 겸자를 사용하여 삽입물을 비조직 배양 6웰 플레이트의 성장 배지 8밀리리터에 즉시 옮기고 세포가 밤새 회복되도록 합니다. 지방 조직의 분화를 시작하려면 삽입물을 8 밀리리터의 지방 생성 배지로 옮기고 매일 배지를 교체하면서 28 일 동안 배양하십시오.
골 연골 단위를 설계하려면 삽입물을 이중 흐름 생물 반응기 챔버에 배치하고 웰을 덮은 다음 35 밀리리터의 골 형성 배지와 35 밀리리터의 연골 형성 배지를 사용하여 분당 5 마이크로 리터의 유속으로 두 스트림을 별도로 주입합니다. 분화를 위해 세포를 28일 동안 유지하여 각 배지 유형에 대해 격주로 주사기 교체를 수행합니다. 섬유아세포를 유도하기 위해, 21일 동안 20 밀리리터의 섬유성 배지를 함유하는 T 150 제곱센티미터 조직 세포 배양 플라스크에서 2D 배양물에서 중간엽 줄기세포를 분화시킨다.
매체의 주간 변화를 유지하십시오. 21 일 후 4 밀리리터의 트립신을 사용하여 세포를 분리하십시오. 인서트 내에 3D 젤을 캡슐화합니다.
활액막과 같은 섬유 조직(SFT)을 얻으려면 유사한 프로토콜을 따르십시오. 내경이 0.062인치이고 외경이 0.125인치인 실리콘 튜브를 한쪽 끝의 미니조인트 바이오리액터 바에 연결하고 다른 쪽 끝의 F 1/16 루어 잠금 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 실리콘 튜브 및 뚜껑과 함께 3D minijoint bioreactor를 오토클레이브합니다.
미니조인트 배양에 사용할 배지 35밀리리터를 준비하여 배지 저장소에 적재합니다. 직선 집게를 사용하여 이중 흐름 생물 반응기에서 미니 관절 생물 반응기의 오른쪽 우물로 골 연골 단위를 옮깁니다. 모든 웰을 멸균 된 뚜껑으로 덮기 전에 지방 조직 삽입물과 섬유 조직 삽입물을 각각 왼쪽 및 중간 웰로 옮깁니다.
미니조인트 클립 유입구를 중간 저장소에 연결하고 배출구를 주사기에 연결합니다. 그런 다음 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 펌프와 칩을 인큐베이터로 옮깁니다.
인큐베이터 외부의 얼음 위에 중간 저장소를 놓습니다. 회수 모드에서 펌프를 작동하여 매체 저장소에서 미니 조인트 생물 반응기 챔버로 매체를 끌어옵니다. 이 미니 조인트 배양 과정을 28 일 동안 계속하십시오.
관절 염증 및 연골 변성을 모델링하기 위해 인터루킨 1 베타를 7 일 동안 밀리 리터당 10 나노 그램의 섬유 성 배지 균주에 첨가하십시오. 섬유성 배지에 신선한 인터루킨 1베타를 제공하기 전에 3일째에 주사기를 교체해야 합니다. 약물 검사의 경우, 인터루킨 1 베타 치료 3 일 후, 관절 내 투여를 시뮬레이션하는 공유 배지 또는 전신 투여를 시뮬레이션하는 모든 배지 유형에서 약물을 투여합니다.
인터루킨 1 베타 치료 7 일 후, 분석을 위해 개별 조직을 수집하십시오. 멸균 집게를 사용하여 삽입물을 제거한 후 삽입물 중앙을 통해 생검 펀치를 밀어 젤을 제거하고 젤을 PBS에 넣습니다. 다음으로, 유전자 발현을 평가하면서 osteochondral gels를 반으로 자릅니다.
14, 000 G에서 10 분 동안 각 배지 소스에서 약 1.5 밀리리터의 배지를 수집하고 원심 분리합니다. 침전물을 버린 후 액체 질소에서 컨디셔닝된 매체를 급속 동결합니다. 조직학적 염색 및 면역 염색의 경우 먼저 골연골 및 활막 유사 섬유 조직 또는 SFT 샘플을 10% 완충된 포르말린에 고정하고 오름차순 농도의 에탄올로 탈수합니다.
자일렌에서 샘플을 제거하고 파라핀에 삽입한 다음 마지막으로 샘플을 6마이크로미터 두께로 분할합니다. 지방 조직의 경우 10% 완충된 형식 및 고정 샘플을 오일 레드 O 용액 또는 BODIPY로 직접 염색합니다. 조직 특이적 표현형은 개별 미세 조직에 대해 잘 유지되었습니다.
미니조인트의 모든 조직을 수집하여 28일간의 배양 후 표현형을 분석했습니다. osteochondral 단위의 미세 조직의 골 성분은 높은 수준의 osteocalcin을 나타냈다. osteochondral의 연골 부분에서, 조직은 콜라겐 유형 2 및 aggrecan의 상당히 높은 수준을 나타냈다.
대표적인 지방생성 유전자인 아디포넥틴과 렙틴의 발현 수준은 지방 조직에서 더 높았다. 칼슘 미네랄, 알칼리성 포스파타제 및 오스테오칼신 단백질의 침착은 주로 골연골 미세 조직의 뼈 크기에서 나타났습니다. 골연골 조직의 연골 쪽은 글리코사미노글리칸과 콜라겐 2형이 잘 유지되는 것으로 나타났습니다.
연골세포 비대 관련 마커인 콜라겐 유형 10 및 인도 고슴도치의 발현은 배양 28일 후에 유의하게 하향 조절되었습니다. 풍부한 지질 액적 침착이 지방 조직에서 발견되었다. 면역형광염색법은 배양 4주 후 SFT에 의해 강력한 루브리신과 카데린 11 발현을 보였다.
질환 모델에서, IL 1 베타 처리는 SFT에서 세포 아폽토시스 및 상승된 MMP-13 수준을 초래하였다. 연골 분해는 IL one 베타에 의해 처리되었으며, 이는 골연골 조직과 SFT 사이의 누화의 발생을 시사합니다. 전신 투여를 통한 나프록센의 치료 효능은 IL 1 베타 미니조인트에서 감소된 연골 분해를 보여주었습니다.
실시간 PCR은 골관절염 약물을 변형시키는 4가지 잠재적 질병이 연골 손실을 부분적으로 역전시키는 것으로 나타났습니다. 이 절차의 가장 중요한 단계는 인서트에서 겔의 가교 결합과 바이오리액터로의 인서트 배치를 포함합니다. 이 칩을 사용하면 비만 및 기계적 부상과 같은 골관절염에서 제공되는 다른 위험 요소의 기여도를 조사할 수 있습니다.
다른 관절 질환을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
