Este protocolo proporciona un método para evaluar el daño vascular como resultado de la perforación de la ventana craneal. Un robot quirúrgico ofrece consistencias mejoradas en todos los procedimientos al tiempo que reduce la cantidad de entrenamiento para aprender la técnica. Durante este procedimiento, utilizamos inyecciones craneales que pueden ser muy desafiantes.
Recomendamos un entrenamiento extensivo para aquellos nuevos en la técnica. Para comenzar, configure el sistema como se describe en el manuscrito y realice la calibración del marco siguiendo el manual del robot quirúrgico. Navegue hasta el software quirúrgico y cree un nuevo proyecto seleccionando comenzar con un proyecto limpio.
A continuación, establezca el sujeto como ratón en la parte superior para designar el atlas de coordenadas de perforación que se utilizará. A continuación, seleccione iniciar nuevo proyecto y haga clic en planificación en la esquina inferior izquierda para navegar a la pantalla de planificación de coordenadas de perforación. Cree el esquema de perforación para la técnica de ventana craneal que se realizará haciendo clic en cualquier parte del atlas estereotáxico.
Use bregma como referencia e ingrese las coordenadas para la corteza motora como se describe en el manuscrito. Pulse Intro en el teclado para actualizar las coordenadas seleccionadas. Haga clic en almacenar destino para guardar estas coordenadas e introducir un nombre adecuado.
Luego haga clic en el botón de mover en la parte inferior izquierda para navegar de regreso a la pantalla principal de perforación. Haga clic en herramientas, luego en proyectar y guardar como opción para reutilizar este proyecto de plantilla para proyectos posteriores, ya que conservará automáticamente las coordenadas de perforación. Primero, administre inyecciones subcutáneas de antibióticos, cefazolina, analgésico, carprofeno y buprenorfina al ratón anestesiado.
A continuación, coloque el ratón en una almohadilla térmica y mantenga la anestesia con 0.5% a 2% isoflurano por inhalación a través de un cono nasal. Monte al animal en el marco estereotáxico del robot quirúrgico utilizando barras para los oídos suministradas y evalúe rutinariamente los signos vitales y la profundidad anestésica a través del pellizco del dedo del pie. Luego frote el área quirúrgica con gluconato de clorhexidina y isopropanol al 70% para la esterilización.
Y coloque una envoltura de plástico estéril sobre el ratón y el marco estereotáctico para mantener la esterilidad durante la cirugía. Usando una hoja de bisturí, realice una incisión de una pulgada en la línea media del cráneo, comenzando en la parte posterior de los ojos, seque y limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% con aplicadores con punta de algodón. Para preparar la cola para una inyección fácil, limpie con alcohol.
Usando el pulgar y el índice, doble la cola para exponer la vena de la cola en la parte superior de la curva de la cola. Inserte la jeringa paralela a la vena e inyecte lentamente el volumen de azul Evans. Una vez inyectado, espere cinco minutos para permitir que circule Evans blue.
Una inyección exitosa se verifica inmediatamente cuando las extremidades del ratón y la ventana quirúrgica se vuelven azules. Una vez que el cráneo esté preparado para la perforación, navegue de nuevo al software quirúrgico y haga clic en herramientas. Luego seleccione proyecto, seguido de nuevo, y seleccione un proyecto de plantilla en el menú desplegable para elegir un proyecto de plantilla.
Seleccione los mismos elementos de protocolo. Haga clic en planificación, luego seleccione los parámetros de perforación para transferir a este nuevo proyecto y haga clic en iniciar nuevo proyecto. A continuación, corrija el taladro y el marco para tener en cuenta la inclinación y la escala del cráneo del ratón del animal actual haciendo clic en herramientas, y seleccione corregir para inclinación y escala para abrir la pantalla de correcciones.
En la parte superior de la pantalla, asegúrese de que el taladro esté activo haciendo clic en el botón de taladro rojo claro Después de realizar la corrección, salga de la ventana de corrección haciendo clic en cerrar en la parte inferior central de la pantalla y navegue hasta la pantalla de perforación haciendo clic en herramientas y luego seleccionando taladro para comenzar el procedimiento de perforación. Confirme el sitio de perforación seleccionando la ventana de forma de craneotomía en la parte superior de la pantalla, seguido de ver los detalles del objetivo de perforación en el menú desplegable a continuación. Para llevar a cabo la perforación por pulsos manual, desactive la función de parada automática desmarcando la casilla de verificación junto a la opción de parada automática en el menú de perforación, que permite controlar cuándo el taladro está apagado para el pulso.
En el menú de perforación, seleccione 100 micrómetros como avance de la profundidad de perforación. Abra el menú del sitio de perforación y navegue hasta el primer sitio de perforación. Utilice el botón de avance o los controles manuales para bajar el taladro hasta que toque el cráneo y presione la superficie de ajuste una vez que la broca llegue al cráneo.
Una vez listo, haga clic en avanzar para comenzar la perforación. Y después de que el taladro haya avanzado 100 micrómetros, presione Escape dos veces para detener el taladro. Después de dos segundos, repita este ciclo para la profundidad del cráneo.
Para cada semilla y punto de borde durante la perforación, asegúrese de ajustar la duramadre usando el botón en el menú de perforación una vez que se haya alcanzado la duramadre. Mida los cambios en la temperatura del cráneo y el cerebro utilizando un termopar en combinación con los tres esquemas de perforación diferentes conectados a un sistema de adquisición de datos, que permite que la medición se lea en MATLAB. Monte un ratón cadáver en el marco estereotáxico y la configuración del taladro robótico.
Perfore manualmente un pequeño orificio aproximadamente a dos milímetros de distancia de donde se hará la ventana craneal en el costado del cráneo, lo que permite que el termopar se deslice en su posición debajo de donde se produce la perforación de la ventana craneal. Comience el proceso de perforación para cada uno de los tres esquemas como se demostró anteriormente, lo que resulta en picos debido al cambio de temperatura, lo que indica que el calentamiento ocurre cerca del cerebro a medida que el taladro atraviesa el cráneo. El potencial de daño térmico se evaluó midiendo el cambio de temperatura desde la línea de base debido a la perforación utilizando métodos horizontales, punto por punto y pulsados punto por punto.
Tanto los esquemas de perforación horizontal como punto por punto muestran diferencias no significativas en los cambios térmicos. Sin embargo, cambiar a un método pulsado punto por punto resultó en un calentamiento significativamente menor del cerebro que la perforación horizontal y punto por punto. La perforación de borde horizontal tomó 300 segundos, mientras que la perforación de borde punto por punto tomó 200 segundos.
El método de pulso tomó el más largo con la perforación de semillas y bordes, tomando aproximadamente 500 segundos cada uno. Para monitorear la relación entre el esquema de perforación y el daño vascular, se realizaron imágenes fluorescentes azules de Evans. Se observó que la perforación a través de corte horizontal y punto por punto era perjudicial para la vasculatura en el cerebro.
En comparación con los grupos de control, el método pulsado punto por punto tuvo menos daño localizado en la semilla y el punto de borde, pero aún tenía presencia visible de azul Evans dentro de la ventana craneal. Al perforar manualmente, es crucial verificar la craneotomía después de avanzar el taladro para asegurarse de que no se rompa la duramadre. Además de las ventanas craneales, se puede usar un robot quirúrgico para craneotomías estándar para mejorar los resultados quirúrgicos.
