Este protocolo fornece um método para avaliar o dano vascular como resultado da perfuração da janela craniana. Um robô cirúrgico oferece consistências aprimoradas entre os procedimentos, reduzindo a quantidade de treinamento para aprender a técnica. Durante esse procedimento, utilizamos injeções cranianas, que podem ser muito desafiadoras.
Recomendamos treinamento extensivo para aqueles que são novos na técnica. Para começar, configure o sistema conforme descrito no manuscrito e realize a calibração do quadro seguindo o manual do robô cirúrgico. Navegue até o software cirúrgico e crie um novo projeto selecionando começar com um projeto limpo.
Em seguida, defina o assunto como mouse na parte superior para designar o atlas de coordenadas de perfuração a ser usado. Em seguida, selecione iniciar novo projeto e clique em planejamento no canto inferior esquerdo para navegar até a tela de planejamento de coordenadas de perfuração. Crie o esquema de perfuração para a técnica de janela craniana a ser realizada clicando em qualquer lugar no atlas estereotáxico.
Use bregma como referência e insira as coordenadas para o córtex motor conforme descrito no manuscrito. Pressione Enter no teclado para atualizar as coordenadas selecionadas. Clique em destino da loja para salvar essas coordenadas e inserir um nome apropriado.
Em seguida, clique no botão mover no canto inferior esquerdo para navegar de volta para a tela de perfuração principal. Clique em ferramentas, projete e salve como opção para reutilizar este projeto de modelo para projetos posteriores, pois ele manterá automaticamente as coordenadas de perfuração. Primeiro, administrar injeções subcutâneas de antibióticos, cefazolina, analgésico, carprofeno e buprenorfina no camundongo anestesiado.
Em seguida, coloque o mouse em uma bolsa térmica e mantenha a anestesia com isoflurano a 0,5% a 2% por inalação através de um cone nasal. Monte o animal na estrutura estereotáxica do robô cirúrgico usando barras auriculares fornecidas e avalie rotineiramente os sinais vitais e a profundidade anestésica através da pinça dos dedos. Em seguida, esfregar a área cirúrgica com gluconato de clorexidina e isopropanol a 70% para esterilização.
E coloque um filme plástico estéril sobre o mouse e armação estereotáxica para manter a esterilidade durante a cirurgia. Usando uma lâmina de bisturi, realizar uma incisão de uma polegada na linha média do crânio, começando na parte de trás dos olhos, secar e limpar o crânio usando peróxido de hidrogênio a 3% com aplicadores de algodão. Para preparar a cauda para injeção fácil, limpe com álcool.
Usando o polegar e o indicador, dobre a cauda para expor a veia da cauda em cima da curvatura da cauda. Insira a seringa paralelamente à veia e injete lentamente o volume de azul de Evans. Uma vez injetado, aguarde cinco minutos para permitir que o azul de Evans circule.
Uma injeção bem-sucedida é imediatamente verificada quando as extremidades do mouse e a janela cirúrgica ficam azuis. Uma vez que o crânio está preparado para perfuração, navegue de volta para o software cirúrgico e clique em ferramentas. Em seguida, selecione projeto, seguido de novo e selecione um projeto de modelo no menu suspenso para escolher um projeto de modelo.
Selecione os mesmos elementos de protocolo. Clique em planejamento, selecione os parâmetros de perfuração para transportar para este novo projeto e clique em iniciar novo projeto. Em seguida, corrija a broca e o quadro para contabilizar a inclinação e o dimensionamento do crânio do mouse do animal atual clicando em Ferramentas e selecione Correto para inclinação e dimensionamento para abrir a tela de correções.
Na parte superior da tela, certifique-se de que a broca esteja ativa clicando no botão vermelho claro Depois que a correção tiver sido executada, saia da janela de correção clicando em fechar no meio inferior da tela e navegue até a tela de perfuração clicando em ferramentas e, em seguida, selecionando broca para iniciar o procedimento de perfuração. Confirme o local da broca selecionando a janela de forma da craniotomia na parte superior da tela, seguida pela visualização dos detalhes do alvo de perfuração na lista suspensa abaixo. Para realizar a perfuração manual de pulso, desative o recurso de parada automática desmarcando a caixa de seleção ao lado da opção de parada automática no menu de perfuração, que permite controlar quando a broca está desligada para o pulso.
No menu de perfuração, selecione 100 micrômetros como o avanço da profundidade da perfuração. Abra o menu do local de perfuração e navegue até o primeiro local de perfuração. Use o botão de avanço ou os controles manuais para abaixar a broca até que ela toque o crânio e pressione a superfície ajustada assim que a broca atingir o crânio.
Depois de pronto, clique em avançar para iniciar a perfuração. E depois que a broca tiver avançado 100 micrômetros, pressione Escape duas vezes para parar a broca. Após dois segundos, repita este ciclo para a profundidade do crânio.
Para cada ponto de semente e borda durante a perfuração, certifique-se de definir a dura-máter usando o botão no menu de perfuração assim que a dura-máter sido atingida. Meça as mudanças de temperatura do crânio e do cérebro usando um termopar em combinação com os três diferentes esquemas de perfuração conectados a um sistema de aquisição de dados, que permite que a medição seja lida no MATLAB. Monte um mouse cadáver na estrutura estereotáxica e na configuração da broca robótica.
Faça manualmente um pequeno orifício a aproximadamente dois milímetros de distância de onde a janela craniana será feita na lateral do crânio, o que permite que o termopar seja deslizado para a posição sob onde ocorre a perfuração da janela craniana. Inicie o processo de perfuração para cada um dos três esquemas como demonstrado anteriormente, resultando em picos devido à mudança de temperatura, indicando que o aquecimento ocorre perto do cérebro à medida que a broca atravessa o crânio. O potencial de dano térmico foi avaliado medindo-se a mudança de temperatura em relação à linha de base devido à perfuração usando métodos horizontais, ponto a ponto e pulsado ponto a ponto.
Tanto o esquema de perfuração horizontal quanto o ponto a ponto mostram diferenças não significativas nas mudanças térmicas. No entanto, a mudança para um método pulsado ponto a ponto resultou em significativamente menos aquecimento do cérebro do que a perfuração horizontal e ponto a ponto. A perfuração de borda horizontal levou 300 segundos, enquanto a perfuração de borda ponto a ponto levou 200 segundos.
O método de pulso levou mais tempo com a perfuração da semente e da borda, levando aproximadamente 500 segundos cada. Para monitorar a relação entre o esquema de perfuração e o dano vascular, imagens fluorescentes com azul de Evans foram realizadas. A perfuração via corte horizontal e ponto a ponto foi vista como prejudicial à vasculatura no cérebro.
Em comparação com os grupos controle, o método pulsado ponto a ponto teve menos danos localizados na semente e no ponto de borda, mas ainda tinha presença visível de azul de Evans dentro da janela craniana. Ao perfurar manualmente, é crucial verificar a craniotomia após o avanço da broca para garantir que a dura-máter não seja rompida. Além das janelas cranianas, um robô cirúrgico pode ser usado para craniotomias padrão para melhorar os resultados cirúrgicos.
