La naturaleza compleja de los EV hace que sea difícil reconocer la subpoblación de interés, y este protocolo puede detectarlos con su fenotipo, perfil de tamaño y propiedades nanomecánicas. Esta combinación de técnica es un método sin etiqueta, que nos permite detectar EV en tiempo real desde los medios de afección y el plasma sanguíneo. Esta técnica permite caracterizar profundamente el subconjunto de nanopartículas de interés, con el fin de ser utilizadas como bioindicadores de patología, o también utilizadas como nanopartículas para la administración de fármacos.
Dado que es un método muy sensible, es imperativo prestar atención a la preparación del biochip antes de inyectar su muestra de interés. Después de recubrir y funcionalizar los chips, incubar el biochip en una mezcla de 200 milimolares de etil dimetilaminopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida y 50 milimolares por litro de N-hidroxisuccinimida durante al menos 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Usando el observador, agregue 300 nanolitros de solución de ligando e incube el biochip bajo un baño sónico durante 30 minutos.
Lave el biochip desde la parte superior con agua ultrapura. Agregue una gota de aceite con el mismo índice de refracción que el prisma para crear una capa delgada uniforme entre el biochip y el prisma, y colóquela suavemente en un prisma con el mismo índice de refracción que el biochip. Para imágenes de resonancia de plasmones de superficie, monte el biochip en el sistema SPRi.
Navegue hasta el menú desplegable en el lado izquierdo del software y haga clic en el directorio de trabajo. Busque la imagen donde se ven diferentes puntos y haga clic para seleccionar esta imagen. Luego escriba el nombre de las familias de ligandos y haga clic en la definición de especies finlandesas.
Arrastre la línea negra con el cursor al ángulo de trabajo óptimo. Haga clic en Mover espejo al ángulo de trabajo y seleccione un ángulo de trabajo. Ahora haga clic en Cinética.
Cuando el software solicite al usuario que defina el control negativo, elija Sin control negativo en este punto. Inyecte albúmina sérica de rata a 50 microlitros por minuto durante cuatro minutos. Inyecte etanolamina a 20 microlitros por minuto durante 10 minutos para desactivar los grupos carboxílicos aún presentes y reactivos en la superficie.
Después, lave el biochip inyectando 40 milimolares OG a 50 microlitros por minuto durante cuatro minutos. Inyectar las vesículas extracelulares a una concentración específica en el chip biofuncionalizado mientras se sigue la cinética de la interacción de las vesículas en los diferentes puntos, simultáneamente. También determine el valor de la reflectividad y el nivel de interacción.
Una vez estabilizado, inyecte glutaraldehído en el chip para fijar las vesículas extracelulares en el lugar donde están antes de realizar imágenes de AFM. Alinee el biochip en la parte superior de la máscara en el portaobjetos de vidrio. Utilice la cámara CCD en la parte superior del AFM para localizar el voladizo en el lugar correcto que debe escanearse.
Comience la adquisición de AFM en modo de contacto de tres a cinco áreas grandes a pequeñas. A continuación, trate las imágenes AFM con el software de procesamiento de datos JPK seleccionando primero el canal de altura. Elija un ajuste polinómico que se restará de cada línea para obtener líneas de escaneo enderezadas.
Seleccione el umbral de altura en los granos de oro para eliminar la rugosidad en la superficie. El módulo de extracción de granos marca los granos utilizando un umbral de altura de 8,5 nanómetros. Los biochips multiplexados se analizaron después de la pasivación de la albúmina.
El chip sin defecto. El chip con algunos defectos, debido a la fusión de manchas, injertos débiles, o burbujas o contaminantes. Y se muestra un chip de oro desnudo sin microarrays para examinar la adsorción de vesículas extracelulares en oro.
El experimento de captura en un biochip multiplexado mostró buenas señales de reflectividad para diferentes ligandos, y una buena relación señal-ruido para los diferentes ligandos, ya que la respuesta del control negativo fue insignificante. La adsorción de vesículas extracelulares después de la inyección de la muestra de vesícula extracelular mostró una señal de alta reflectividad, lo que sugiere que esas vesículas pudieron adsorberse y permanecer estables en el chip de oro. Después de la carga de vesículas extracelulares, se generaron imágenes AFM a gran y pequeña escala de vesículas extracelulares en biochips.
Una vista más cercana de alta resolución permite la metrología de vesículas extracelulares. El diámetro efectivo de las vesículas extracelulares en un biochip varió de 30 a 300 nanómetros, con una gran mayoría alrededor de 60 nanómetros. Los resultados obtenidos en aire y líquido fueron comparables.
El espectro Raman de vesículas extracelulares adsorbidas en un chip desnudo reveló un espectro claro, con picos que corresponden principalmente a vibraciones de metileno, que están asociadas con los lípidos de las membranas de vesículas extracelulares. Es importante preparar su biochip rigurosamente para poder detectar sus vehículos eléctricos con precisión y de manera reproducible. Los métodos convencionales como el western blotting y el análisis de seguimiento de nanopartículas se pueden utilizar para correlacionar y confirmar fenotipos y patrones de tamaño.
Además, se prevé que los análisis multiómicos profundicen aún más en la caracterización molecular de EV y la posible discriminación de subconjuntos.
