Reconocemos el apoyo a la investigación por el Programa de Investigación Intramural del NIBIB, NIH.

Muestra la Asamblea Celular y Torque <ol><li> Comenzamos la construcción de la muestra de células uniendo dos montajes de ventana. Coloque una junta de ventana en el soporte de la ventana. Coloque el revestimiento de la ventana (o es algunas veces llamado un amortiguador de la ventana) en el interior del soporte de ventana para que la abertura de la camisa se encuentra frente a la ranura del soporte. Con una ligera inclinación, coloque la ventana en el soporte de la alineación de la marca escriba en la ventana con la forma en clave del titular de la ventana. Presione con suavidad en los bordes muy a ambos lados de la ventana. </li><li> Para garantizar el cierre y el par exacto de la celda de muestra, cubrir ligeramente la junta de la vivienda y la rosca con un lubricante Spinkote. Extender una pequeña cantidad de Spinkote entre el pulgar y el índice. Cubra las roscas rosca con una fina capa invisible de Spinkote. Del mismo modo, cubra la junta de la vivienda. Limpie cualquier lubricante visible. </li><li> Iniciación de Montaje de la muestra de células de un montaje de ventanas corredizas, con la ventana que daba hacia usted, en la caja del celular mediante la alineación de la ranura de la llave de la vivienda. Alinear la ranura central con la llave de la vivienda y se deja caer suavemente en la parte superior del montaje de ventanas dentro de la célula. </li><li> Nunca utilice ningún tipo de herramienta para empujar la pieza central en la caja del celular. Esto podría causar daños permanentes en el CP que resulta en pérdida durante los experimentos. Gire el conjunto segunda ventana para que la ventana esté mirando hacia el centro, lejos de ti, alinear chavetero con llave de vivienda y deslice hacia abajo en la parte superior de la central. Coloque una junta de vivienda en la parte superior, entonces, una tuerca por lo que la palabra &quot;Out&quot; es visible. Con los dedos y una herramienta de alineación, apriete la rosca. Si el CP no se desliza fácilmente en el barril de la vivienda, la primera alineación, entonces, colocar el conjunto de segunda ventana en la parte superior de la misma. Al aplicar presión a la baja suave en el montaje de ventanas, deslice ambos en la caja del celular al mismo tiempo. De esta manera, evitar presionar directamente en el PC. Ahora es un buen momento para mirar dentro de la célula de polvo, pelusas y las huellas dactilares. También se dará cuenta de los Anillos de Newton que indican que aún queda aire entre el PP y las ventanas. Estas desaparecerán después de la aplicación de torque. </li><li> Con la rosca y la palabra &quot;fuera&quot; visible, coloque la celda muestra todo el camino hasta el interior de la pinza par de células de la pie de torque. Mantenga la célula en su lugar mediante la aplicación de una presión constante sobre el mango de pie de torque. En un movimiento continuo, apriete la rosca de entre 120 a 140 en-libras. Si se utiliza una llave de torsión ajustable micrómetro, se establece en entre 120 a 140 in / lbs y apriete la rosca hasta que la llave haga &quot;clic&quot; que indica el par de giro se ha alcanzado. Suelte la palanca de pie de par y retire con cuidado la celda de la muestra sin tocar las ventanas. </li></ol> De carga y sellado de la celda de la muestra <ol start="6"><li> Para los experimentos de velocidad de sedimentación, de manera rutinaria cargar un volumen de 400ul en cada sector de la piedra angular de 12mm con una pipeta 200ul. La posición de la celda de muestra con los orificios de carga en la parte superior y la palabra &quot;out&quot; en la rosca visible. Deslice la punta de la pipeta hasta la mitad en el sector central de la izquierda a través de los orificios de carga y poco a poco prescindir de 200ul de solución de referencia. Repetir una vez a un total de 400ul. Utilizando la punta de la pipeta mismo y la misma técnica, con cuidado y lentamente llenar el sector central de la derecha con 400ul de solución de la muestra. Volúmenes de 150 a 180 ul se utilizan para los experimentos de equilibrio de sedimentación, pero el mismo cuidado y la técnica se debe seguir. Es imprescindible para que coincida con los volúmenes de las soluciones de referencia y la muestra lo más cerca posible. Colocación de la punta de la pipeta con firmeza en la pipeta, poco a poco la carga y distribución de soluciones, evitando las burbujas de carga y el uso de la misma punta de la pipeta para ambas soluciones a todos ayudar a mantener el volumen lo más equitativa posible. </li><li> Sello de la célula mediante la colocación de dos nuevas juntas de clavija de la vivienda perfectamente en cada agujero de carga asegurándose de que están situados entre la pieza central y la carcasa de aluminio. Cubra cada uno con un enchufe de la vivienda. Apriete a mano con un destornillador plano pequeño. </li></ol> Alineación de la celda de la muestra en el rotor <ol start="8"><li> Antes de cargar el rotor, asegúrese de que el contrapeso no es más que 0,5 g más ligera que la célula de muestra en la posición opuesta en el caso de que las filtraciones de la celda de muestra. Comience con el saldo en cero. Primer pesaje de la célula de la muestra que estará en posición opuesta al CB. Tarar la balanza para restar peso de la célula de la muestra, entonces, pese la CB. Sumar o restar el peso del orificio de fijación del contrapeso. Asegúrese de que los pesos no sobresalen de la parte superior. Pesar de nuevo para asegurarse de que el contrapeso final está dentro de 0,5 g más ligera que la célula de muestra lo contrario. </li><li> El uso de un rotor de 4 posiciones, coloque el contrapeso en la posición 4, de manera que la flecha blanca es visible y apuntando en tque la dirección de la fuerza centrífuga. Asegúrese de que está todo el camino hasta el interior del rotor. Suavemente apriete el tornillo de fijación, que se encuentra en la parte superior del contrapeso justo al otro lado de la flecha blanca, hasta que el contrapeso es firme en su lugar, pero aún capaz de ser alineados. La posición de la celda de muestra equilibrada con los tapones de vivienda que enfrenta el centro del rotor y la palabra &quot;out&quot; en la rosca visible. </li><li> Mirando desde debajo del rotor, alinear la marca de escribano en el interior (la marca más cercana al centro del rotor) con la marca de escribano en el contrapeso mediante una herramienta de alineación. Apriete el tornillo de fijación para bloquear contrarrestar alineados en su lugar. De la misma manera, alinear la celda de la muestra marca escribano con la marca escriba en el interior en la posición 2 en el rotor. </li></ol> Para más información, consulte <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

El montaje adecuado de las células, la inserción de la muestra, y la alineación de celdas en el rotor es fundamental para la alta calidad de los experimentos AUC. Esto es cierto, en particular, para los experimentos que requieren un análisis muy detallado de los datos obtenidos en los perfiles de sedimentación macromoleculares, por ejemplo, al estudiar las interacciones de proteínas y la determinación de trazas agregado. A menudo, la calidad del montaje del experimento se limita a la exactitud y la precisión de los resultados del estudio de las AUC. Para más detalles sobre el diseño y la ejecución práctica de experimentos AUC, ver Referencias 1 - 3. Talleres sobre la configuración de práctica, teoría y análisis de los datos de los experimentos de las AUC están llevando a cabo dos veces al año en nuestro laboratorio en los Institutos Nacionales de Salud [4].

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

La ultracentrifugación analítica (AUC) es una poderosa herramienta biofísicos que nos permite grabar perfiles macromoleculares de sedimentación durante el centrifugado de alta velocidad. Cuando está bien planificada y ejecutada, una velocidad de sedimentación AUC o el experimento de equilibrio de sedimentación puede revelar mucho acerca de una proteína en cuanto a tamaño y forma, pureza de la muestra, el coeficiente de sedimentación, los estados de oligomerización y las interacciones proteína-proteína. Esta técnica, sin embargo, requiere un nivel riguroso de atención técnica. Las células de la muestra tienen un pedazo de centro sectorizado intercalada entre dos conjuntos de la ventana. Ellos son sellados con una presión de par de aproximadamente 120 a 140 in / lbs. Buffer y muestra se cargan en los sectores central y luego de sellado, las células están perfectamente alineados en un rotor de titanio, para que los sistemas de detección de lectura óptica tanto de la muestra y el tampón de referencia en la línea media trayectoria radial misma a través de cada sector central, mientras que giran a velocidades de hasta 60, 000 rpm y bajo vacío muy alto No sólo es el montaje adecuado de células de la muestra crítico, componentes de la muestra de células son muy caros y deben ser debidamente atendidos para asegurar que están en óptimas condiciones de trabajo a fin de evitar fugas y roturas durante los experimentos. Manejar con cuidado las ventanas, por la más mínima grieta o rasguño puede conducir a la rotura en la centrífuga. El contacto entre el centro y ventanas deben ser lo más ajustado posible, es decir, sin los anillos de Newton s debe ser visible después de la presión se aplica el par. Polvo, pelusas, los arañazos y los aceites ya sea en el centro de la ventana o todo compromiso y este contacto puede conducir fácilmente a la filtración de soluciones de un sector a otro o se escape de la central todos juntos. No sólo son muestras valioso que se perdió, la filtración de soluciones durante un experimento se producirá un desequilibrio de presión en la celda que a menudo conduce a la rotura de cristales y centros de mesa. Además, las juntas de enchufe y clavijas de vivienda debe estar en su lugar para evitar soluciones que se retiró del sector central a través de los orificios de carga por el alto vacío en la cámara de centrifugado. Revestimientos de las ventanas y las juntas deben estar libres de roturas y grietas que podrían causar el movimiento resultante de las ventanas rotas. Este vídeo demuestra nuestros procedimientos de montaje de la muestra de células, el par, la carga y la alineación del rotor para ayudar a minimizar el daño a los componentes, la solución de fugas y roturas durante el experimento perfecto AUC.

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Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.

Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K vistas.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.

Video: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Investigación

Biología

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Montaje, ajuste y uso de un microscopio de campo Apertureless de Infrarrojo Cercano para la imagen de proteínas

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un enfoque alternativo para la preparación de muestras con bajo número de celular para el análisis TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Cinta-cáscara de estomas: Un método mejorado para la preparación de la muestra de protector de la célula

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...