The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

NOTA: El procedimiento puede llevarse a cabo en los tejidos congelados frescos o flash. Se recomienda perfundir tejidos altamente vascularizados con PBS en el momento de la disección para eliminar los glóbulos rojos y las proteínas plasmáticas. No se recomienda realizar el procedimiento en tejidos fijados como la fijación (es decir, la reticulación química) interfiere con descelularización y también puede comprometer significativamente el análisis de espectrometría de masas subsiguiente. Durante todo el procedimiento, se recomienda el uso de tubos de baja retención y puntas de pipeta para maximizar la recuperación de proteínas y péptidos. 1. Descelularización de tejidos o tumores NOTA: Antes de empezar, prepare los reactivos y añadir inhibidores de la proteasa (suministradas con el kit de extracción de proteínas Compartimiento) para el volumen deseado de cada búfer. Todos los tampones y las muestras deben mantenerse en hielo durante la duración del experimento excepto el Buffer CS que necesita ser mantenido a RT para evitar la precipitación SDSsanea-. NOTA: El protocolo usa una serie de incubación en los tampones de diferente pH y que contiene diferentes cantidades de sales y detergentes secuencialmente proteínas intracelulares extraer y enriquecer para las proteínas ECM insolubles (Figura 1, Tabla 1; ver también la discusión de alternativas para el uso de la kit comercial se detalla aquí). Los volúmenes de los reactivos que figuran a continuación son para 100 mg de tejidos o tumores (ver Tabla 1) y necesitan ser ajustados apropiadamente. <ol><li> Homogeneizar 100 mg de tejido en 500 l de tampón C que contienen inhibidores de la proteasa utilizando un homogeneizador de tejidos hasta que el tejido está completamente interrumpido y se obtiene una suspensión homogénea. NOTA: Añadir desoxirribonucleasa I (concentración final: 200 g / ml, reconstituido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y ribonucleasa A (concentración final: 20 mg / ml, reconstituido de acuerdo con las instrucciones del fabricante) aBuffer N. </li><li> Extracción secuencial de las proteínas solubles intracelulares <ol><li> La extracción de las proteínas citosólicas. Incubar el homogeneizado en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Guardar una pequeña alícuota (10 l 20 l) del homogeneizado por Western blot posterior (véase la sección Resultados esperados y la Figura 2). </li><li> Centrifugar el homogeneizado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio, esto constituirá la fracción citosólica (C) del análisis de transferencia Western. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C. </li><li> Para lavar, resuspender el precipitado en 400 l de tampón W que contiene inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Centrifugar el homogeneizado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para extraer, proteínas nucleares, resuspender el precipitado en 150 l de tampón de N que contienen inhibidores de la proteasa, deoxyribonuclease I y ribonucleasa A e incubar la muestra en un tubo de rotador durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo limpio. Repita este paso una vez: después de centrifugar la muestra para el segundo tiempo, añadir el sobrenadante al sobrenadante anterior: esto constituirá la (N) de la fracción nuclear análisis de transferencia Western. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C. A continuación, realice los lavados según el paso 1.2.3. </li><li> Para extraer proteínas de la membrana, resuspender el precipitado en 100 l de tampón M que contienen inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 30 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C </li><li> Recoger el sobrenadante en un tubo limpio: esto constituirá la fracción de membrana (M) de la Western blot. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C. </li><li> Para extraer las proteínas del citoesqueleto, resuspender el precipitado en 200 l de tampón de CS que contienen inhibidores de la proteasa e incubar la muestra en un rotador tubo durante 30 min a RT. Tenga en cuenta que el sedimento no se disolverá completamente. Se aconseja interrumpir el precipitado pipeteando arriba y abajo hasta la observación de la interrupción de la pastilla. </li><li> Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 30 min a TA. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio. Nota en este punto una marcada disminución adicional en el tamaño de la pastilla (ver video). </li><li> Resuspender el precipitado en 150 l de inhibidores de la proteasa que contiene tampón C y se incuba la muestra en un rotador tubo durante 20 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir al sobrenadante anterior: esto constituirá la fracción citoesqueleto (CS) de la Western blot. Flash congelar esta fracción y almacenar a -80 ° C. </li><li> Realizar lavados adicionales. Resuspender el precipitado en 500 l de PBS que contenía inhibidores de la proteasa unand incubar la muestra en un rotador tubo durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Repita este paso tres veces. NOTA: Todos los rastros de detergentes necesita ser eliminado por extensos lavados antes de la digestión de las proteínas en péptidos (véase la sección 3). En este punto, el sedimento ECM-enriquecido puede ser-flash congelado y se mantiene a -80 ° C. Tenga en cuenta que el tamaño de la pastilla dependerá de la cantidad de (ECM) proteínas insolubles en el material de partida y la eficiencia de la descelularización. </li></ol></li></ol> 2. Control de la Calidad de la Descelularización / ECM Enriquecimiento por SDS-PAGE y Western Blot <ol><li> Mezclar 10-20 l alícuota del extracto total de tejidos y 50 alícuotas de las fracciones intermedias con Laemmli Buffer contenía DTT 100 mM. Resuspender el, fracción insoluble ECM-enriquecido en 3x Laemmli tampón que contenía DTT 100 mM. Nota: se eleva la concentraciónde la TDT y SDS ayudar en la solubilización de las proteínas ECM que son relativamente insolubles. </li><li> Separar las proteínas mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. </li><li> Realice inmunes transferencias utilizando anticuerpos para controlar las proteínas representante de cada una de las fracciones citosólicas, nucleares, de membrana, citoesqueleto y ECM (véase la sección Resultados Representante, Tabla 2 y la Figura 2). </li></ol> 3. Dentro de la solución de digestión de las proteínas a péptidos para el Análisis de espectrometría de masas NOTA: El sedimento obtenido después del procedimiento descelularización y la eliminación de SDS es altamente enriquecido en proteínas ECM insolubles para su posterior análisis por espectrometría de masas estas proteínas deben ser digerido en péptidos. Tenga en cuenta que, como consecuencia de ECM proteína insolubilidad, no es posible en este paso para medir la concentración de proteína de la muestra. Por lo tanto ofrecemos volúmenes de reactivos para digerir el ECM-enrimuestras CHED en péptidos basados ​​en el tamaño (mm) o el peso seco de la pastilla ECM-enriquecido (Tabla 3). Las soluciones de bicarbonato de amonio, urea, DTT, yodoacetamida y ácido trifluoroacético todos necesitan ser recién preparado. <ol><li> Resuspender la muestra ECM-enriquecido añadiendo el volumen apropiado de 8 M urea al sedimento ECM-enriquecido y añadir TDT a una concentración final de 10 mM (véase la Tabla 3). Incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. NOTA: en este punto las proteínas ECM no serán totalmente disueltos y las visiblemente grandes partículas de proteína no deben ser eliminados por centrifugación o filtración. La suspensión se borrará al desglucosilación y la digestión (ver video). </li><li> Alquilación <ol><li> Prepare la solución de yodoacetamida en agua grado HPLC. Enfriar la muestra a temperatura ambiente y añadir el yodoacetamida a una concentración final de 25 mM. Para la alquilación completa, la TDT: relación de yodoacetamida debe estar entre 1: 2.5 y 1: 3. </li><li> Incubar en la oscuridad durante 30 min a TA. </li></ol></li><li> Desglicosilación: Se necesita desglicosilación para eliminar las cadenas laterales de hidratos de carbono que interfieren con la identificación de péptidos modificados por glicosilación N = Conectado: Nota. <ol><li> Diluir con 2 M de urea con bicarbonato de amonio 100 mM pH 8,0 y agregue la cantidad apropiada de PNGasaF (ver Tabla 3). Incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Digestión <ol><li> Añadir Lys-C e incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas a 37 ° C. Añadir la tripsina y se incuba con agitación continua a 1.400 rpm O / N a 37 ° C. NOTA: la suspensión ECM-rica que comenzó nublado después de la reconstitución inicial en 8M urea parece claro después de O / N digestión (ver video). </li><li> Añadir una segunda alícuota de tripsina a la muestra e incubar con agitación continua a 1.400 rpm durante 2 horas más a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Acidificación <ol><li> Una vez completada la digestión, inactivar la tripsina mediante la acidificación de la muestra recién preparada con 50% ácido trifluoroacético (TFA). La muestra debe llegar a pH &lt;2. Se aconseja la adición de 1-1,5 l de 50% de TFA en un momento y usando 1 l de la solución de péptido para medir el pH de la solución con papel de pH (ver video). </li><li> Centrifugar la muestra acidificada a 16.000 xg durante 5 min a TA. Recoger el sobrenadante en un tubo de baja retención limpio. En este punto, la solución de péptido se puede almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Desalación Nota: que este último paso se realiza normalmente en una instalación de la espectrometría de masas en función de sus propios métodos preferidos. <ol><li> Antes del análisis de proteómica, desalar las muestras y los péptidos eluidos con recién preparada acetonitrilo 60%, ácido trifluoroacético al 0,1%, seguido de concentración en un concentrador de vacío. Resuspender los péptidos en recién preparada 3% acetonitrIle, 0,1% de ácido trifluoroacético 8. NOTA: que después de la desalación, la concentración de la solución de péptido puede ser medido por espectrofotometría (ver sección resultados esperados). </li><li> Ahora analizar la muestra por espectrometría de masas, de nuevo de acuerdo con los procedimientos óptimos de las instalaciones de espectrometría de masas. NOTA: Animamos a los investigadores interesados ​​en la caracterización de la composición de ECM utilizando la espectrometría de masas para referirse a las otras publicaciones 8-10 y sitios Web que proporcionan una explicación más detallada, incluyendo parámetros de LC-MS / MS, búsqueda de datos de espectrometría de masas para el análisis de la identificación de proteínas y datos utilizando el silico matrisome herramienta de anotación en hemos desarrollado 8. </li></ol></li></ol>

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Modificaciones Aunque hemos empleado este procedimiento exacto para enriquecer el ECM de diez tejidos y tipos de tumores 8-10, modificaciones del protocolo debe ser considerada en los siguientes casos: 1) Detección de proteínas ECM en las fracciones intermedias. Matrices extracelulares de diferentes tejidos o tipos de tumores pueden diferir en su capacidad de extracción / insolubilidad, como se discutió anteriormente para fibronectina y laminina. Por ejemplo, se piensa que la ECM de los tejidos fibróticos o tejidos de remodelación da la vuelta muy dinámicamente y por lo tanto se podría observar una mayor proporción de proteínas ECM en aquellos tejidos a ser más fácilmente extractable 12. Dependiendo de la fracción en la que se detectan las proteínas ECM, se sugiere reducir el tiempo de incubación de la etapa de provocar la extracción de proteínas ECM u omitir ese paso. 2) Detección de una proporción significativa de los componentes intracelulares en el sedimento ECM-enriquecido. En algunos tejidos o tipos de tumores de las células de relación: ECM es (tumores por ejemplo, hígado, bazo, no desmoplásicos) particularmente altas. En ese caso, una contaminación significativa de la fracción de ECM-enriquecido con proteínas intracelulares (proteínas del citoesqueleto en particular y / o histonas) se puede observar. Para agotar las proteínas intracelulares de manera eficiente, le sugerimos que se repiten dos veces la incubación en Tampón M y / o Buffer CS (ambos detergentes que contienen, esto generalmente agota abundantes proteínas intracelulares). Otra alternativa sería utilizar tampones alternativos con concentraciones de detergente mayores, con la salvedad de que esto puede conducir al agotamiento de las proteínas ECM relativamente más solubles también (véase el párrafo siguiente). 3) alternativa al uso de un kit comercial. No hemos podido, por razones de propiedad, para obtener la composición precisa de los buffers from el proveedor del kit de extracción de proteínas compartimental. Sin embargo, hemos incluido en el Cuadro 1 notas basadas en nuestra propia experiencia utilizando tampones caseros con detergente definido (NP-40, desoxicolato de sodio y SDS) concentraciones de realizar extracciones similares. Un estudio reciente también destacó la importancia de que el pH de los tampones Descelularización retener proteínas ECM 13. Limitaciones de la técnica El método que aquí se presenta se basa en el hecho de que las proteínas ECM son intrínsecamente más insoluble que la mayoría de las proteínas intracelulares. Sin embargo, el método descrito aquí sin duda descelularización extrae los componentes solubles presentes dentro de la ECM, tales como algunos factores de crecimiento o enzimas ECM-remodelación. Aunque las proteínas ECM-asociado fuertemente unidos a las proteínas ECM fueron detectados por la proteómica en las muestras preparadas como se describe, este método puede ser demasiado estrictas al perfil completamente la composición de matrisome asociadaproteínas. Importancia de la técnica con respecto a otros métodos La ventaja del método presentado aquí sobre otros métodos es que puede ser adaptado a la naturaleza de la ECM de interés: pasos intermedios se puede omitir o repetir para evitar la pérdida de proteínas ECM o aumentar el agotamiento de las proteínas contaminantes intracelulares respectivamente. Este método también sólo utiliza cantidades mínimas de detergentes que se enjuaga para evitar su interferencia con la preparación de péptidos posterior y espectrometría de masas. Finalmente, el método descrito aquí para digerir preparaciones de proteínas ECM-rico en péptidos tiene también la ventaja de no requerir proteínas sean solubles y pueden llevarse a cabo en fracciones de ECM enriquecida &quot;en bruto&quot;. Descelularización métodos alternativos que utilizan agentes caotrópicos (tales como hidrocloruro de guanidina) para estudiar la composición del ECM por espectrometría de masas han been reportado en la literatura (revisado en 14) y se han utilizado en combinación con espectrometría de masas para caracterizar la composición ECM del cartílago 15,16, corazón 17, glándula mamaria 18 y vascular 19 y 20 membranas basales glomerulares. Recomendaciones Métodos que emplean descelularización tripsina para digerir a las células no deben utilizarse si ECMs se enriquecen para la proteómica posteriores análisis, como tripsinización se traducirá en la digestión parcial ECM y la pérdida de proteínas ECM y péptidos. Del mismo modo, si la digestión con colagenasa se fuera a usar para ayudar a la interrupción del tejido, que tendría que ser supervisados ​​cuidadosamente, ya que causa la digestión ECM y la pérdida de proteínas ECM y péptidos. Dentro de la solución frente a la digestión en gel? Proteínas ECM son reticulado y altamente insoluble y, incluso cuando se resuspendieron en tampón de 3x Laemmli (que contiene 6% de SDS) y 100 mM de DTT, po separadoorly en geles de SDS. Así, en la digestión-gel no es un método preferido. Las futuras aplicaciones Vale la pena señalar que, si bien no se discute aquí, la composición de cada una de las fracciones intermedias recogidos durante la descelularización podría también ser analizado por espectrometría de masas. Esto puede ser particularmente valioso en el estudio de muestras muy pequeñas (es decir, biopsias humanas) o cuando se desea información sobre otras fracciones celulares.

La matriz extracelular (ECM) es una compleja malla de proteínas reticulados y glicosilada que proporciona soporte arquitectónico y anclaje de las células y define, en parte, las propiedades biomecánicas tejidos &#39;1,2. Proteínas ECM también señalan a las células ya sea directamente a través de sus receptores (por ejemplo, integrinas, syndecans, etc.) o mediante la modulación de la señalización del factor de crecimiento 3. Así, el ECM ofrece señales biofísicas y bioquímicas que son importantes reguladores de los procesos celulares como la proliferación, la supervivencia, la polarización, la diferenciación, la migración, etc. El ECM desempeña un papel clave en la fisiología, el desarrollo y el envejecimiento 4. Por otra parte, varias patologías, como las enfermedades cardiovasculares, la fibrosis, enfermedades músculo-esquelético, cánceres son causados ​​por o como resultado, las alteraciones de ECM. Además, el ECM contribuye al mantenimiento de nichos de células madre y la identificación de moléculas de ECM clave then atención al stemness tendrán aplicación directa en la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa 5. Sin embargo, a pesar de su importancia, el ECM ha permanecido, hasta hace poco, poco explorada 6. En silico análisis ha revelado que el matrisome, que se define como el conjunto de ECM y proteínas ECM-asociado, comprende los productos de varios cientos de genes, tanto en el humano y el ratón genomas 1,7,8. Sin embargo, la insolubilidad de las proteínas ECM ha obstaculizado la caracterización sistemática de la composición in vivo de matrices extracelulares de especímenes normales y patológicas. Recientemente hemos demostrado que esta insolubilidad podría convertirse en una ventaja y ser usado para enriquecer las proteínas ECM 8-10. Nosotros y otros demostraron además que la espectrometría de masas era un método de elección para caracterizar la composición de ECMs de 8 - 10, 13. Nosotrosdescribir aquí un procedimiento descelularización que consiste en incubaciones secuenciales en tampones de diferente pH y concentraciones de sal y detergentes. Este procedimiento resulta en la extracción (o agotamiento) de las proteínas citosólicas, nucleares, de membrana y del citoesqueleto y el enriquecimiento de las proteínas de ECM. A continuación, describimos cómo digerir preparaciones de proteínas ECM enriquecido en péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas. Usando los procedimientos detallados e ilustrado aquí, hemos enriquecido con éxito y que se caracteriza por espectrometría de masas de las matrices extracelulares de diez diferentes tejidos y tipos de tumores: pulmonar normal murino 8, humanos y de colon murino 8,9, hígado humano 9, tumores colorrectales humanos y derivados metástasis hepáticas 9, xenoinjertos de melanoma 8, xenoinjertos tumorales mamarias 10, islotes pancreáticos de murino y insulinomas murinos (Naba et al., sin publicar). Comparación de los diferentes matrisomes revelaron firmas de ECM en tejidos y específicos de tumores que más podrían ser utilizados como potenciales biomarcadores de diagnóstico o pronóstico. Creemos que este procedimiento puede ser aplicado a otros especímenes con o sin modificaciones relativamente menores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

La matriz extracelular (ECM) es una compleja malla de proteínas reticuladas que proporciona señales biofísicas y bioquímicas que son importantes reguladores de la proliferación celular, la supervivencia, la migración, etc. El ECM desempeña un papel importante en el desarrollo y en diversas patologías que incluyen cardio-vascular y las enfermedades músculo-esquelético, la fibrosis y cáncer. Por lo tanto, la caracterización de la composición de ECMs de los tejidos normales y enfermos podría conducir a la identificación de nuevos biomarcadores de pronóstico y diagnóstico y nuevas dianas terapéuticas potenciales. Sin embargo, la naturaleza misma de las proteínas ECM (grandes en tamaño, reticulados y unidos covalentemente, fuertemente glicosilada) ha hecho que los análisis bioquímicos de ECMs desafiante. Para superar este desafío, hemos desarrollado un método para enriquecer ECM de los tejidos y tumores frescos o congelados que se aprovecha de la insolubilidad de las proteínas ECM. Se describe aquí en detalle el procedimiento descelularización que consiste en i secuencialncubations en tampones de diferente pH y concentraciones de sal y de detergente y que los resultados en 1) la extracción de intracelular (citosólico, nuclear, membrana y citoesqueleto) proteínas y 2) el enriquecimiento de las proteínas ECM. A continuación, describimos cómo deglycosylate y digerir preparaciones de proteínas ECM enriquecido en péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas.

Control de calidad del procedimiento descelularización La eficiencia de la descelularización puede ser monitorizado mediante el análisis del contenido de proteína de cada fracción por Western blot. Tabla 2 enumera las proteínas de valor diagnóstico para evaluar la calidad del procedimiento de descelularización. La Figura 2A muestra la extracción eficiente en las fracciones intermedias de citosólica (GAPDH ), nucleares (histonas), la membrana (integrina β1) y del citoesqueleto (actina) las proteínas, mientras que no hay proteínas ECM (colágeno I) se detectaron en estas fracciones (Figura 2). A su vez, el sedimento final se enriquece para proteínas ECM y en gran medida agotado de proteínas intracelulares (Figura 2A). Figura 2B presenta el agotamiento de proteína intracelular satisfactoria (no se detecta ninguna de las histonas en la fracción rica en ECM), aunque, actina todavía se puede detectar en la fracción ECM-rico y el agotamiento de colágeno I monomérico- Peso molecular aparente ~ 110 kDa, presuntamente correspondiente al colágeno sin montar I - se puede observar en la fracción CS. También supervisamos rutinariamente proteínas ECM adicionales, tales como fibronectina y laminina, aunque, en algunos tejidos estos componentes pueden ser parcialmente solubilizados en fracciones 8-10 anteriores. Por ejemplo, la fibronectina también se produce como fibronectina plasmática soluble que no está incorporado en el ECM. La perfusión del tejido antes de la extracción reduce la concentración de fibronectina plasmática, pero no siempre elimina. En algunos tejidos, lamininas se encuentran débilmente asociadas con la superficie celular o la ECM y el extracto en fracciones intermedias. Si esto ocurre, puede abordarse mediante la alteración de las condiciones de extracción (véase la discusión). Tenga en cuenta que el enriquecimiento de las proteínas ECM y el agotamiento concomitante de componentes intracelulares se basa en la solubilidad relativa de las proteínas en los diferentes tampones. Thes difiere entre diferentes tejidos - en algunos casos, las histonas y la actina se extraen más fácilmente que en otros. También observamos que, aunque se espera que las histonas que ser extraído de la fracción N (Figura 2B), que a menudo se observa un agotamiento más completo de las histonas en la M o fracción CS (Figura 2 A y B). Concentración de péptido indicativo esperado La concentración de la solución de péptido obtenida después de la digestión, la acidificación y la desalación se puede medir por espectrofotometría midiendo la absorbancia de la solución de péptido utilizando la longitud de onda de 280 nm correspondiente al triptófano, tirosina, o el uso de la longitud de onda de 205 nm correspondiente a la absorbancia del péptido bonos. Se midió la concentración de las soluciones de péptidos obtenidos a partir de la descelularización de tres muestras de pulmones murinos (82 mg, 100 mg y 100 mg, respectivamente) preparoja en paralelo y obtuvo de cada uno: 424 ng / l, 450 ng / l, y 580 ng / l de péptidos respectivamente. Identificación de péptidos ECM por espectrometría de masas Análisis de espectrometría de masa de la composición de las muestras de proteínas ECM enriquecido, preparado como se describe aquí, mostró que&gt; 70% de la intensidad de la señal corresponde a ECM y proteínas ECM asociada a 8-10. Tabla 1. Volumen de reactivos de kit de extracción para compartimental decellularize 100 mg (peso húmedo) de tejido o tumor. Esta tabla muestra la composición y el volumen de cada tampón utilizado para llevar a cabo la descelularización de 100 mg de tejido o tumor. Un cóctel de inhibidores de la proteasa se ​​proporciona como una solución 50x y necesita ser agregado a cada búfer 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivos de Kit Compartimiento proteína Extracción </td><td> El volumen de 100 mg de tejido </td><td> Composición (basado en Millipore ficha técnica gato # 2145 1) </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 500 l </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl2, KCl, EDT 4, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio 5 </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 l </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> Buffer N </td><td> 150 l x 2 </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, NaCl, EDTA, glicerol, ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 l </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> Buffer M </td><td> 100 l </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, desoxicolato de sodio (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> Buffer CS </td><td> 200 l </td><td> TUBOS (pH 6,8), MgCl2, NaCl, EDTA, sacarosa, dodecil sulfato de sodio (SDS) 7, ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 150 l </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl2, KCl, EDTA, sacarosa, glicerol, ortovanadato de sodio </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 l / lavado </td><td> - </td></tr></tbody></table> Notas: 1 Por razones de propiedad, que no pudieron obtener la composición exacta de los buffers del fabricante del kit, pero incluimos aquí algunas notas basadas en nuestra propia experiencia utilizando tampones caseras para llevar a cabo extracciones similares. 2 inhibidor de la proteasa: es aconsejable incluir una variedad de inhibidores contra la cisteína, serina y treonina peptidasas, esterasas de serina, metaloproteinasas de cationes divalentes dependiente etc.Existen muchos cócteles inhibidores de proteasa disponibles comercialmente. 3 pH por encima de 7,0 es un inhibidor eficaz de las proteasas lisosómicas. 4 EDTA (generalmente utilizado en 2 mM) es un inhibidor eficaz de proteasas dependiente de cationes divalentes. 5 ortovanadato de sodio es un inhibidor de la fosfatasa. Una concentración típica eficaz sería 0,5-5 mM. 6 NP40 al 0,1% -0,5% es suficiente para solubilizar los lípidos de membrana más. La combinación de NP40 y DOC - utiliza a menudo en concentraciones iguales (por ejemplo, 0,5% de cada uno) - se utiliza a menudo como una extracción más estrictas que aún deja muchas interacciones proteína-proteína intacta. 7 SDS es un detergente iónico más riguroso (CMC 0,1%). También se puede utilizar en combinación con los otros dos detergentes SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% como tampón rigurosidad intermedia. Tabla 2. proteínas de diagnóstico asupervisar la calidad del procedimiento de descelularización. Esta tabla enumera ejemplos de proteínas que son características de cada compartimento subcelular (citosol, núcleo, membrana plasmática, citoesqueleto y ECM) que se puede utilizar para controlar la calidad del procedimiento de descelularización y la eficiencia de la ECM-enriquecimiento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Compartimiento intracelular </td><td> Las proteínas de diagnóstico </td></tr><tr><td> Proteínas citosólicas </td><td> Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) </td></tr><tr><td> Proteínas nucleares </td><td> Las histonas, laminas, nucleoporin </td></tr><tr><td> Las proteínas de membrana </td><td> Las integrinas, receptor de transferrina </td></tr><tr><td> Proteínas del citoesqueleto </td><td> Actina, tubulina, vimentina </td></tr><tr><td> Proteínas ECM membrana basal </td><td> El colágeno IV, nidogens, lamininas </td></tr><tr><td> Proteínas ECM intersticiales (intersticiales) </td><td> El colágeno I, colágeno III, colágeno VI, fibronectina </td></tr></tbody></table> Por recomendación sobre anticuerpos, vea nuestras publicaciones 8-10. Tabla 3. Volumen de reactivos para digerir muestras ECM enriquecido en péptidos. Esta tabla muestra los reactivos utilizados para volver a suspender las muestras de proteínas ECM enriquecido y reducir, alquilato, deglycosylate y digerir las proteínas en péptidos muestras antes del análisis de espectrometría de masas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reactivos </td><td> Preparación </td><td> Final de Concentración / Monto de pellets de 1 mm de espesor (~ 5-10 mg de peso seco) </td><td> El volumen de pellets de 1 mm de espesor (~ 5-10 mg de peso seco) </td></tr><tr><td> Bicarbonato de amonio (NH 4 HCO 3) </td><td> Solución 100 mM en agua grado HPLC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Solución 8 M en bicarbonato de amonio 100 mM </td><td> 8 M </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> Ditiotreitol </td><td> Reconstituir con agua grado HPLC a 500 mM </td><td> 10 mM </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Yodoacetamida </td><td> Reconstituir con agua grado HPLC a 500 mM </td><td> 25 mM </td><td> 2,5 l </td></tr><tr><td> Péptido N -Glycosidase F (PNGasaF) </td><td> Solución comercial a 500 U / l </td><td> 1000 U </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> Endoproteinasa LysC, grado espectrometría de masas </td><td> Reconstituir con agua grado HPLC a 0,5 mg / l </td><td> 1 g </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> Tripsina, la masa de grado espectrometría (ronda 1) </td><td> Solución comercial a 0,5 mg / l </td><td> 3 g </td><td> 6 l </td></tr><tr><td> Tripsina, la masa de grado espectrometría (ronda 2) </td><td> Solución comercial a 0,5 mg / l </td><td> 1,5 g </td><td> 3 l </td></tr><tr><td> Ácido trifluoro-acético (TFA) </td><td> Solución al 50% en agua de grado HPLC </td><td> - </td><td> 2.5 l </td></tr><tr><td> El acetonitrilo (elución) </td><td> Solución al 60% con 0,1% de TFA en agua de grado HPLC </td><td> - </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> Acetonitrilo (reconstitución) </td><td> Solución de 3% con 0,1% de TFA en agua de grado HPLC </td><td> - </td><td> 100 l </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Esquema del procedimiento experimental. Esquema de flujo de trabajo de la protocol a decellularize tejidos (Sección 1), el control de la calidad de la descelularización y evaluar el enriquecimiento de ECM (Sección 2) y digerir muestras de proteínas ECM enriquecido en péptidos antes de análisis de espectrometría de masas (Sección 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Control de calidad del procedimiento de descelularización por Western blot Western blots se realizaron en pulmón murino (A) y de xenoinjerto de carcinoma mamario humano (B) muestras utilizando los siguientes anticuerpos:. Conejo anti-actina (clon 14-1) y anti conejo -β1 integrina anticuerpos producidos en el laboratorio; conejo anti-colágeno I, ratón anti-GAPDH y anticuerpos de conejo anti-pan-histonas eran de Millipore. Después de la incubación del anticuerpo primario, las membranas se lavaron y se incubaron en presencia de HRP-conjugado de cabra anti-conejo o de cabra anti-mouSE anticuerpo secundario de Jackson ImmunoResearch Laboratory. Finalmente, las membranas se lavaron y se incubaron en Western relámpago ™ Reactivo de Quimioluminiscencia (PerkinElmer LAS). * Indica contaminación histona residual mínima de la fracción ECM-ricos. ** Indica el agotamiento parcial de monómero (presuntamente sin montar) colágeno I en la fracción de CS. *** Indica contaminación actina residual de la fracción ECM-rico. El frotis detectado con el anticuerpo anti-colágeno representa diferentes niveles de modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, reticulación, glicosilación).

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Enriquecimiento de la Matriz Extracelular Las proteínas de los tejidos y la digestión en péptidos para el análisis de espectrometría de masas

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.6K vistas.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Presión atmosférica de Imagen Molecular de los tejidos biológicos y biopelículas por LAESI Espectrometría de Masas

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flujo de trabajo completo para el análisis de las histonas modificaciones post-traduccionales El uso de espectrometría de masas de abajo hacia arriba: A partir de la histona Extracción de Análisis de Datos

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Preparación de muestras para análisis de proteómica basado en la espectrometría de masa de microvasos Ocular

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...