We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).

1. Medición de búfer de energía en un flujo Instrumento extracelular: Dos Variaciones NOTA: los cálculos y métodos descritos aquí se desarrollaron utilizando un extracelular Flux Analizador. Para otros instrumentos, el volumen de medición debe hacerse a escala adecuada. <ol><li> Preparar 0,1 M HCl estándar en agua usando HCl concentrado (ver Materiales y Equipos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Un ejemplo de cálculo para preparar las inyecciones de HCl para su uso en los cuatro puertos de inyección se muestra en la Tabla 1: </li></ol><img alt="Mesa 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tabla 1. consecutivos inyecciones de HCl en un ensayo de flujo extracelular así. <ol start="2"><li> Preparar diluciones del patrón HCl en el medio a ensayar como en la Tabla 1 para el número de repeticiones técnica siendo carrIED en un plato, más uno para permitir que para el error de pipeteo, por ejemplo, durante cuatro repeticiones técnica del puerto Una inyección, prepare un stock de (1,1 l x 5) HCl 0,1 M en (48,9 l x 5) medio de ensayo. </li><li> Distribuir 50 l en cada puerto A del cartucho sonda de medición. Repita este procedimiento para el resto de los puertos B, C y D. </li><li> Ejecutar un ensayo de flujo extracelular 10 con un ciclo de calibración estándar, seguido por dos ciclos de [mezcla 2 min, 1 min de espera, y la medición 5 min] para cada una de las cuatro adiciones de puerto (véase la Figura 2). <ol><li> Programar el experimento anterior en el software de instrumento de acuerdo con las instrucciones del software. Cargar el cartucho preparado en la máquina y realizar la calibración de acuerdo con las instrucciones de software. </li><li> Cuando se le pregunte por el programa, quite la placa que contiene calibrante-e inserte la placa que contiene medio de ensayo en cada pocillo en el instrumento; continuar el programa. </li></ol></li><li> U<html> cantar la media de 8-10 puntos de datos obtenidos en estado estacionario (típicamente los últimos 8-10 puntos) antes y después de cada adición puerto, calcular la diferencia (acumulativo) en el pH (ΔpH) causado por cada inyección de ácido estándar. </li><li> Trazar ΔpH contra nmol H + contenido en el volumen 7 l atrapado por la sonda de medición. La pendiente lineal es el poder tampón (BP) en mph / pmol H +. </li><li> Como alternativa a los pasos 1,2-1,3, llevar a cabo las mediciones ΔpH tras un ensayo en el que los puertos A, B y C se utilizan para la realización de un experimento, seguido de una inyección HCl en Puerto D. Como en la Tabla 2, cuatro repeticiones técnica son utilizado para generar cada punto de una curva estándar de 5 puntos en los 20 pozos experimentales (con exclusión de los pozos de corrección de temperatura de cuatro fondo) de la placa de ensayo de flujo extracelular. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tabla 2. HCl sola inyección en un ensayo de flujo extracelular también. 2. Medición de búfer de energía El uso de un medidor de pH externo NOTA: Para medir el poder de tamponamiento de un medio usando una sonda de pH externo, calibrar la sonda a 37 ° C y mantener esta temperatura durante todos los reactivos durante el experimento. <ol><li> Preparar 0,1 M HCl estándar en agua usando HCl concentrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Sonda de pH caliente, las normas de pH, el medio de ensayo cuyo poder de tamponamiento se va a medir, y 0,1 M de HCl a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Calibrar sonda de pH a 37 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantener todos los reactivos a 37 ° C durante todo el ensayo utilizando una placa de calor o baño de agua. </li><li> Alícuota de 10 ml del medio de ensayo en un pequeño vaso de precipitados o tubo cónico. Monitorear el pH de forma continua utilizando una sonda de pH sumergido. </li><li> Añadir HCl 0,1 M a la comodecir medio en 10-20 alícuotas. <ol><li> Asegurar una mezcla mediante el uso de una barra de agitación o por agitación manualmente el recipiente después de cada adición de ácido. </li><li> Espere unos segundos para la medición de pH se estabilice y luego grabar el pH después de cada adición. </li><li> Como se demuestra en la Tabla 3, que un número suficiente de adiciones para asegurar cálculo de la pendiente correcta y para cubrir el rango de pH esperado durante el experimento. </li></ol></li></ol><img alt="Tabla 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tabla 3. Medición de poder tampón utilizando un medidor de pH. Los datos representan un experimento típico con seis 20 mu l de HCl 0,1 adiciones M. <ol start="6"><li> Parcela ΔpH contra nmol H + añadido por 7 l, dando una pendiente lineal que representa el poder tampón (Figura 1). </li></ol> Figura 1. La determinación de poder tampón. Curva estándar HCl mide como en la Tabla 1, Tabla 2 o (aquí) como en la Tabla 3. La pendiente de la curva de ajuste lineal da el poder de tamponamiento (pH / nmol H + en 7 l). Cada punto representa la media ± SEM de n = 9 repeticiones técnica. <ol start="7"><li> Una vez que el poder tampón se conoce a través Método 1 o 2 anterior, convertir la señal ECAR (mph / min) para PPR (H + / proteína min / g pmol) dividiendo ECAR por la precarga de potencia (BP) (mph / pmol H +) y la ampliación del contenido de proteína de cada pocillo: PPR tot (pmol H + / min / mg de proteína) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + en 7 l) / proteína por pozo (g) La ecuación 6 </li><li> Como alternativa, utilice los mismos experimentos en Métodos 1 o 2 para calcular el (BC) Valor Buffering Capacidad utilizada por el software del instrumento para calcular automáticamente PPR durante la recolección de datos. NOTA: El manual del usuario del instrumento 12 (página 107) proporciona información detallada sobre el cálculo y el uso de la capacidad amortiguadora, donde antes de Cristo se describe como BC (mol / L) = moles H + / (ΔpH volumen de tampón x (L)) Ecuación 7 NOTA: La capacidad de tamponamiento tal como se define en la Ecuación 7 se puede calcular en los ensayos de instrumento o sonda de pH externo descritos anteriormente. Conversión entre el poder tampón y capacidad de amortiguación se hace fácilmente (ver hoja de cálculo adjunta): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + en 7 l) / 7 l) La ecuación 8 NOTA: Si se conoce antes de realizar el ensayo, la capacidad de amortiguación se puede introducir directamente en el software del instrumento durante la configuración experimental. </li><li>Aplicar este procedimiento y los cálculos utilizados anteriormente para la mayoría de los sistemas tampón convencionales, como se describe en la publicación anterior 6. NOTA: La Tabla 4 enumera el poder tampón y capacidad amortiguadora de varios medios de comunicación convencionales. </li></ol><img alt="Tabla 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tabla 4. poder tampón y capacidad de amortiguación de los medios seleccionados. 3. Realización de un Ensayo de flujo extracelular utilizando células C2C12 mioblastos NOTA: En el paso 3.4.3, no hubo diferencias observadas en CO 2 -derivado dependiente de la producción de ácido en la presencia de la anhidrasa carbónica en la cultura C2C12, lo que sugiere que su presencia no es necesaria para la plena conversión de CO 2 a la HCO 3 - + H +. Sin embargo, la prueba empíricamente esto en diferentes sistemas experimentales se recomienda antes de omanhidrasa carbónica itting. <ol><li> Cultura del ratón C2C12 mioblastos 13 a 37 ° C bajo 95% de aire / 5% de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glucosa 11,1 mM, glutamina 2 mM, 10% v / suero bovino fetal v (FBS), 100 U / ml penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> 24 hr antes del ensayo, las células / placa de semillas en 100 l de medio de cultivo de la misma a 20.000 células / pocillo en una placa de ensayo de 24 pocillos de poliestireno extracelular de flujo (ver Materiales y Métodos) sin la capa adicional. </li><li> Diluir oligomicina, FCCP, y la rotenona más myxothiazol, y HCl (opcional) a 10x concentración final de Krebs Ringer fosfato HEPES (KRPH) medio de ensayo (2 mM HEPES, NaCl 136 mM, 2 mM NaH 2 PO 4, 3,7 mM KCl, 1 2 mM de MgCl, 1,5 mM CaCl 2, 0,1% w / v albúmina de suero bovino graso libre de ácido, pH 7,4 a 37 ° C). </li><li> Preparación celular <ol><li> 30 min antes del ensayo, las células adherentes lavar tres veces por aspiración a gently eliminar el medio del pozo y después añadiendo lentamente 500 l KRPH. </li><li> Se incuban las células después de la tercera etapa de lavado a 37 ° C en el aire (no menos del 5% de CO 2, lo que altera el pH de este medio-bicarbonato gratis). </li><li> Al inicio del ensayo, sustituir KRPH en pozos con 500 l KRPH fresco que contiene la anhidrasa carbónica 500 U / ml y, o bien glucosa (10 mM) o sólo medio, sin sustrato adicional. </li></ol></li><li> Carga del cartucho del sensor <ol><li> Pipetear 50 ml de alícuotas de cada compuesto 10x preparado en la etapa 3.3 en los puertos de cartucho de un cartucho extracelular flujo sensor de la siguiente manera (concentraciones finales en el ensayo así dan): Puerto A: 2 mg / ml oligomicina, Puerto B: 0,5 M FCCP, Port C : 1 rotenona mu M, 1 M myxothiazol, Port D: HCl (si se realiza una calibración de ácido en el ensayo como se describe anteriormente y en la Tabla 2). NOTA: A los efectos de la inhibición completa de la cadena respiratoria se describe aquí, 1 mM misxothiazol se puede usar de forma intercambiable con 1 M de antimicina A. </li></ol></li><li> Ensayo de flujo extracelular: <ol><li> Realizar un ensayo de flujo extracelular estándar para determinar el control respiratorio como se describe en 10. </li></ol></li></ol> NOTA: Para cada segmento del experimento, determinar la mezcla, espera, y los tiempos de medición deseada, así como el número de ciclos por segmento. NOTA: Los datos de la Tabla 5 se recogieron más de dos ciclos de ensayo de 2 mezcla min, 1 min esperar, y 5 min medida para cada segmento, con tres ciclos de ensayo que ocurre después de la adición Port D de diferentes cantidades de HCl (para la calibración de búfer de potencia como en la Tabla 2). <img alt="Tabla 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tabla 5. configuración de ensayo de flujo extracelular. 4. Measuring Fin de punto de concentración de lactato NOTA: Para validar el ensayo indirecto descrito aquí en algún sistema diferente, la concentración de lactato punto final al final de un experimento de flujo extracelular se puede determinar directamente en una placa de 96 pocillos convencional mediante la medición de la velocidad inicial (más de 2 min) de la reducción de NAD + NADH → catalizada por la lactato deshidrogenasa, descrito con detalle en nuestra publicación previa 6. Para los datos presentados en resultados representativos, la concentración de lactato punto final en los pocillos de ensayo que contienen glucosa era ~ 40 mM. <ol><li> Preparar medio de hidrazina 2x: 1 M Tris, EDTA 20 mM, hidracina 400 mM, pH 9,8 a 22 ° C). Inmediatamente antes del inicio del ensayo, agregar NAD + a 4 mM y lactato deshidrogenasa (LDH) a 40 U / ml. La composición del medio de ensayo final (1x): Tris 500 mM, EDTA 10 mM, 200 mM de hidrazina, 2 mM NAD +, 20 U / ml LDH. </li><li> Inmediatamente después del ensayo de flujo extracelular, retirar 100l de medio de ensayo de cada pocillo de la placa de ensayo de flujo extracelular y la transferencia a un pocillo de una opaco (negro) placa de 96 pocillos. </li><li> Para cada muestra bien, añadir 100 l 2x medio de hidracina. </li><li> Cargar inmediatamente la placa en un lector de microplacas y comenzar a supervisar la fluorescencia de NADH a 340 nm de excitación / emisión a 460 nm. </li><li> Registre la velocidad inicial de aproximadamente 2 min. </li><li> Ejecutar un experimento similar para construir una curva estándar trazando velocidad inicial en contra de la concentración de lactato para las concentraciones de lactato añadido de 0 a 50 mM. </li><li> Calcular la concentración de lactato en cada pocillo experimental usando la curva estándar. </li></ol> 5. La medición de contenido de proteínas <ol><li> Retire medio de ensayo restante de cada pocillo de la placa de ensayo. </li><li> Lavar los pocillos tres veces con 250 l KRPH-BSA libre, teniendo cuidado de minimizar el desprendimiento de las células de la superficie del fondo del pozo. </li><li> Añadir 25 l de lisis RIPAmedio (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, 1 mM EGTA, EDTA 1 mM, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v desoxicolato de sodio, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 a 22 ° C) a cada pocillo de la placa de ensayo. </li><li> Incubar la placa en hielo durante 30 min. </li><li> Agite la placa en un agitador de placas a 1200 rpm durante 5 min. </li><li> Medir la concentración de proteína por métodos estándar, por ejemplo, por ensayo BCA, asegurando que la composición de tampón de lisis es compatible con el método de medición. El contenido de proteína en el experimento en la figura 2 fue de ~ 4 mg / pocillo. </li></ol>

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Dr. Shona Mookerjee declara que no tiene intereses financieros en competencia. Dr. Martin Brand ha consultado para Seahorse Biosciences, que produce instrumentos y reactivos utilizados en el presente artículo. Cuotas de acceso abierto para este artículo fueron pagados por Seahorse Biosciences.

Acidificación extracelular es una indicación de fácil medición de la tasa metabólica celular. Para determinar correctamente la tasa de glucólisis celular (tal como se define por la producción de lactato) es fundamental para conocer el poder tampón del medio de ensayo, y para convertir las mediciones de flujo extracelulares de consumo de oxígeno y acidificación para protón tasas de producción. Mediante la realización de este cálculo, la acidificación resultante de CO 2 liberado en el ciclo del ácido cítrico se puede restar, dejando la acidificación que resulta de la producción de lactato. Las múltiples formas diferentes dadas aquí para medir la potencia de amortiguación para esta corrección llevan diferentes ventajas y desventajas. Medición externa utilizando una sonda de pH es muy precisa y reproducible, pero puede no reflejar pequeñas diferencias en la detección de pH introducida por los fluoróforos contenidos dentro de la placa de ensayo, la adición de compuestos durante el ensayo, o la presencia de tél propias células. La mediciones de pH abordan en placa estas cuestiones, pero también introducen diversos grados de ruido experimental. La corrección CO 2 a ECAR permite por primera vez el cálculo inequívoca y cuantitativa de la tasa de glucolítica, y revela variación de contribución respiratorio y glucolítica a ECAR total durante el curso de un experimento. Utilizando la ecuación 5 y las medidas de OCR, ECAR, y amortiguar la energía, la tasa glucolítica se puede calcular utilizando la simple hoja de cálculo proporcionada (Tabla 6). Esta tasa puede ser verificada mediante la medición de lactato post-hoc si se desea 6. En las células, donde la vía de las pentosas fosfato es altamente activo, el uso de inhibidores de la vía, tales como 6-aminonicotinamida puede ser útil para aislar tasa glucolítica. Cálculo de las contribuciones tanto de CO 2 - y el lactato derivado de H + del total miden extracelular acidificación tarifas y oxígeno Consumption El precio es una herramienta invaluable para el uso de los datos de flujo extracelular hacer declaraciones poderosas y cuantitativos sobre la actividad metabólica. Usando los procedimientos descritos aquí, incluyendo diversas modificaciones para medir el poder tampón, y optimizando el experimento de flujo extracelular de las células bajo investigación y los datos deseados, la tasa de glucólisis en células intactas se puede cuantificar en una amplia gama de condiciones experimentales. Este método está limitado a células que pueden crecer en cultivo adherente sobre (o células u orgánulos que se puede adherir a) una superficie de poliestireno. Es más fiable cuando las células cultivadas son homogéneos y confluyentes, aunque los datos útiles aún se pueden obtener en un rango de estas condiciones. Los cálculos requieren algún conocimiento del metabolismo de las células, como max + H / O 2 rangos de 0,65 a 1,0 para la oxidación completa de los diferentes sustratos y más para la oxidación parcial 6, sin embargo, si las células son known para oxidar la glucosa, un valor de 1,0 se puede suponer. Aunque pertinente para todos los caracterización metabólica, este método puede ser particularmente útil cuando se utiliza en sistemas en los que un cambio entre el metabolismo respiratorio y glicolítica para mantener el suministro de ATP celular es un fenotipo crítica, incluyendo la caracterización de las células madre y las células cancerosas derivadas de tumores. La comprensión de las alteraciones de control metabólico en estos y otros contextos permitirá un mayor grado de sofisticación y precisión en el diseño experimental y el análisis de estos tipos de células.

El objetivo general de este método es medir con exactitud la tasa glucolítica de células por medio de análisis de flujo extracelular. La medición cuantitativa de la tasa glucolítica utilizando acidificación extracelular es el punto final deseado de muchos experimentos. Sin embargo, la tasa total de la acidificación extracelular es la suma de dos componentes: la acidificación respiratoria, en forma de CO 2 (que hidrata a H 2 CO 3 y luego se disocia de HCO 3 - + H +), y la acidificación glicolítica, en forma de lactato - + H +. Las contribuciones de CO 2 a la acidificación extracelular total de hasta hace poco han sido considerados insignificantes en la plataforma de medición utilizado aquí, el analizador XF24 7. Sin embargo, es evidente en otros múltiples sistemas que el CO2 puede ser un importante contribuyente a 04.05 acidificación extracelular. Múltiples documentos reconocen esta estafacontribución, pero no intente cuantificación directa de CO 2 -derivado 3,8,9 ácido. Recientemente hemos demostrado cuantitativamente que la producción de CO2 es una fuente importante de acidificación extracelular en este sistema 6. Por otra parte, aunque hay múltiples vías metabólicas que generan CO 2 del catabolismo de la glucosa, las realizadas por deshidrogenasas matriz en el ciclo del ácido cítrico son los contribuyentes abrumadoras y todas las demás fuentes generan cantidades de CO 2 que se encuentran dentro del error experimental 6. Sin la corrección de producción de CO 2, la acidificación extracelular, por tanto, es un indicador de la tasa de ambigua glucolítica y no se puede utilizar cuantitativamente. Nuestra publicación anterior pone de manifiesto varios casos en que respiratoria CO 2 comprende la mayor parte de la señal total acidificación, incluso en las células en general se cree que utilizar principalmente la glucólisis 6. Además, elrespiratoria CO 2 contribución a la acidificación total varía ampliamente durante el curso de los experimentos de perfiles metabólicos comunes, lo que demuestra que la correcta comparación de la tasa glucolítica durante las diferentes partes de un experimento requiere corrección para el CO 2. Para medir la tasa glucolítica de células por medio de la tasa de acidificación extracelular, es necesario convertir los cambios de pH a los cambios en total H + generados, y para restar la acidificación extracelular causada por CO 2 liberado durante el funcionamiento del ciclo del ácido cítrico. Aquí se describe un método sencillo para medir la tasa de producción de protones extracelular (de cambios extracelulares en el pH y la potencia calibrada tampón del medio de ensayo) y la producción de CO 2 (a partir de los cambios extracelulares en O 2 concentración), y demostrar cómo calcular la tasa glucolítica el uso de estas mediciones. Esta fortaleza método<html> ens la utilidad de la medición de la acidificación extracelular, al usarla para calcular correctamente tasa glicolítica tal como se define por la producción de lactato. Sin corrección para CO respiratoria 2 (o la medición directa de lactato), es imposible para determinar si y en qué medida la tasa total de la acidificación refleja tasa glucolítica, confundiendo la interpretación de los experimentos que utilizan la acidificación extracelular total como medida directa de la producción de lactato. CÁLCULOS CO 2 y el lactato son, dentro del error experimental, los dos únicos contribuyentes a la producción de ácido extracelular, basados ​​en experimentos con células de mioblastos 6. Por lo tanto, la tasa de acidificación extracelular total de (PPR, la tasa de producción de protones) se puede definir como: PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Ecuación 1 . _content &quot;&gt; donde tot = total, resp = respiratoria; Glyc = glucolítica glicolítica PPR es así: PPR Glyc = PPR tot - PPR resp Ecuación 2 Aquí, PPR tot = ECAR tot / BP Ecuación 3 donde ECAR = tasa de acidificación extracelular (mph / min), y BP = poder tampón (mph / pmol H + en 7 l), mientras que PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1)) (máx H + / S 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Ecuación 4 donde K 1 = constante de equilibrio combinado de CO 2 de hidratación y la disociación de HCO 3 - + H +; max H + / S 2 = XXe CO 2 acidificación -derivado de una transformación metabólica particular, tales como la oxidación completa de la glucosa 6; OCR = tasa de consumo de oxígeno (O 2 pmol / min), y OCR rot / myx = no mitocondrial OCR. Ecuación 4 aísla mitocondrial OCR restando cualquier OCR no mitocondrial (definido como OCR que es resistente a los venenos respiratoria rotenona y myxothiazol mitocondrial) y representa el máximo de H + generado por O 2 consumido para cada sustrato (max H + / O 2 ) (ver 6), así como la proporción de CO 2 dando lugar a H + a la temperatura experimental y pH (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1). Para la oxidación completa de la glucosa, oxígeno mitocondrial Consumo Rate (OCR) es exactamente igual a la tasa de producción de CO 2. En el volumen de ensayo confinados de la medición de flujo extracelular, CO 2 productosd por la respiración permanece atrapado en el medio de ensayo. La mayoría de los atrapados CO 2 se hidrata a H 2 CO 3, que luego se disocia de HCO 3 - + H +. Una pequeña fracción permanece disuelto pero no hidratada, y otra pequeña fracción es hidratado pero no disociado, según lo dictado termodinámicamente por la constante de equilibrio combinado de CO 2 hidratación y la disociación de HCO 3 - + H + a temperatura experimental (37 ° C) y pH (~ 7,4). Por lo tanto, la ecuación completa para el cálculo de PPR g restando PPR resp del PPR tot es: PPR Glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1)) (máx H + / S 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Ecuación 5 yon esta manera, las tasas de respiración y la glucolisis, así como sus tasas de producción de ATP asociados, puede determinarse cuantitativamente a partir de mediciones directas (consumo de oxígeno, la acidificación extracelular, capacidad de tamponamiento) y la importación o el cálculo de otros valores requeridos (H + E / S 2 , P / O, y el equilibrio constante K 1) 6. El experimento descrito aquí se expande sobre las técnicas estándar para usar el extracelular Flux Analizador como Seahorse XF24 10,11; para otros formatos de medición de flujo extracelular (por ejemplo, XF e 96, o XFP), todos los volúmenes inferiores deben ser escalados apropiadamente. El poder de tamponamiento del medio de ensayo se puede medir por la construcción de una curva estándar, ya sea directamente en la plataforma de flujo extracelular o por separado usando una sonda de pH calibrado. Aquí, se dan tres opciones para medir buffering por el medio de ensayo de flujo extracelular, incluyendo el uso de todos los injectien los puertos del analizador de flujo extracelular con pocillos de muestras libres de células, o usando sólo el último puerto de inyección en pozos que contiene células (sección 1) o mediante el uso de una medición de pH externo (sección 2). Consulte la hoja de cálculo adjunta para los cálculos completos de datos de ejemplo. Para medir la potencia utilizando la capacidad amortiguadora del pH de detección del instrumento de flujo extracelular, lo más seguro es utilizar pozos sin células para minimizar la variación de la señal. Sin embargo, dentro del error, no existe diferencia estadística entre libre de células y los pozos cuando se realiza esta medición que contiene células (datos no presentados). NOTA: La variación descrito en la etapa 1.7 lleva la ventaja de dar cuenta de los cambios potenciales para el almacenamiento en búfer conferidos por compuestos añadidos o por la presencia de células, con la desventaja de señal más ruido. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, no se encontraron diferencias significativas en el poder tampón calculada entre el diseño libre de células se muestra en la Tabla 1 yel diseño post-experimento en la Tabla 2, en las condiciones experimentales descritas aquí. Además, en rangos pequeños ΔpH (&lt;0,4 unidades; experimentalmente mejor restringidas a 0,2 unidades), la pendiente lineal obtiene representando Δ MPH / pmol H + aproxima adecuadamente la relación logarítmica entre ΔpH y [H +]. La pendiente de esta curva estándar por lo tanto, representa el poder tampón del medio de ensayo bajo prueba en pH / nmol H + en 7 l, o mph / pmol H + en 7 l. Se recomienda aumentar el poder de tamponamiento medio o disminución de la densidad celular para las muestras que exceden un cambio unitario 0,2 pH durante el tiempo de medición. El tiempo de medición también se puede disminuir, pero esto puede reducir la tasa de acidificación estado estacionario e introducir error en el cálculo de la tasa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pherastar FS</td>
			<td>BMG</td>
			<td>n/a</td>
			<td>microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF-24</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>n/a</td>
			<td>extracellular flux instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF assay plate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>V7-PS</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>38280</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myxothiazol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5580</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonic anhydrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2624</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3991</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7004</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1254</td>
			<td>chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

<html> La Figura 2 muestra los datos en bruto para un experimento típico. Los últimos 10 puntos de medición a partir de la grabación de punto a punto tanto de OCR y pH (sombreado barras verticales) se utilizaron para los cálculos. Las preocupaciones iniciales de que el valor medio (medición del punto medio) de cada ciclo de ensayo no proporcionarían suficiente resolución de tarifa para un cálculo preciso, especialmente en lo que parecía haber un ligero retraso entre Además puerto y velocidad de acidificación estado estacionario, no fueron confirmadas, ya que esto no parece contribuir significativamente a un error de cálculo (no mostrado). Alternativamente, si se introduce la capacidad de amortiguación correcta durante la instalación experimental, PPR se puede leer directamente de la lectura de la recopilación de datos de instrumentos, mostrando la salida de PPR en el software del instrumento o en el formato compatible con PC disponible como uno de los ajustes de salida de datos. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Representante rastros de flujo extracelular de O 2 y H +. OCR y pH traza para el experimento de ejemplo en la Tabla 5, que contiene glucosa 10 mM al inicio del ensayo. Port D tenía diferentes concentraciones de HCl para la calibración de la potencia de amortiguación (no se muestra en estas trazas promediados). Los datos de publicación anterior 6. Cada punto representa la media ± SEM de n = 8 repeticiones biológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Análisis de los datos de los resultados representativos El uso de la hoja de cálculo se muestra en la Tabla 6 y proporcionado como un archivo adjunto, valores de los datos de los pozos individuales pueden ser introducidos en las columnas que se muestran con encabezados de color amarillo. Todos los seis columnas a<html> el derecho se calcula a partir de estas entradas. El ejemplo en la Tabla 6 muestra los cálculos de PPR resp y PPR Glyc usando ECAR y datos OCR de los pozos individuales para las condiciones nativas, con o sin glucosa añadida, antes de la adición de Port A oligomicina. Técnico repeticiones en cada preparación biológica normalmente se promedian para dar valores individuales de las salidas en los últimos cuatro columnas, a continuación, los datos de diferentes preparaciones biológicas se promedian con la propagación adecuada de las estadísticas de error en BP y estos cuatro valores. <img alt="Tabla 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tabla 6. Cálculo de las vías respiratorias y la acidificación glucolítica. Las columnas encabezadas en amarillo indican los valores que se introduzcan de cálculo (por ejemplo, BP, max H + / O 2), o de recopilación de datos (por ejemplo, tot ECAR, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla. | <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">Por favor haga clic aquí para descargar la tabla como una hoja de cálculo Excel .</a> Aportes de la glucólisis y respiración a PPR después de la corrección La Figura 3 muestra la representación gráfica de los datos calculados como en la Tabla 6 para las tasas de nativos de la acidificación glucolítica y respiratorio, las tasas siguientes oligomicina adición (Puerto A), y las tasas siguientes FCCP adición (Puerto B). Estos datos demuestran claramente cómo (añadidos glucosa vs. control (ctl) con ninguno) las proporciones de cambio respiratorio y glicolítica acidificación con elección de sustrato y con el estado mitocondrial (función nativa vs. función farmacológicamente alterada). &quot;&gt; <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Figura 3. protones tasa de producción (PPR) de fuentes glucolíticas y respiratorias. PPR de la respiración (porciones abiertas) y la glucólisis (porciones llenas) de las células C2C12 calculados utilizando la ecuación 5 con glucosa añadido (tres barras de la izquierda) o sin glucosa añadido (tres barras de la derecha). Los datos de 6. Todos los datos representan la media ± SEM de n = 8 repeticiones biológica.

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Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Medición y Análisis de la producción de ácido extracelular para Determinar glicolítica Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

24.9K vistas.  Touro University California College of Pharmacy. Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

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Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Investigación

Biología

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un método de alto rendimiento para la medición de la tasa de filtración glomerular en ratones conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Medición de la extracelular Ion fundentes Uso del referencias Ion selectivo microelectrodos Técnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

La medición de la producción de dióxido de carbono a partir de sustratos radiomarcados en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...