Este protocolo describe los pasos detallados para usar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el tratamiento de diferentes medicamentos y radiación. Esto ayudará a los lectores a establecer un cribado de fármacos de semi-alto rendimiento que implique la exposición a rayos X utilizando embriones de pez cebra, lo que guiará en la evaluación de la radiotoxicidad y la eficacia de los diferentes fármacos utilizados. Este procedimiento se puede utilizar para cribar y validar o evaluar diferentes fármacos como potenciales radiosensibilizadores o protectores, que pueden ser explorados más a fondo o utilizados en el campo de la radioterapia o la radiobiología del cáncer.
Para comenzar, monitoree los embriones en crecimiento bajo el microscopio de disección. Identifique la etapa adecuada y elimine los embriones muertos o enfermos. Asegúrese de que la estadificación embrionaria sea adecuada para la radiación y que las dosis del fármaco se administren en una etapa particular de gastrulación.
Antes de comenzar el experimento, distribuya cuidadosamente los embriones sanos en las placas experimentales con la ayuda de una pipeta Pasteur. Para cada grupo experimental, tome de 15 a 20 embriones. Al organizar un experimento de radiación, incluya un grupo de control no irradiado y un grupo de solo radiación.
Distribuya los embriones en una placa de pocillos si los escudos de radiación pueden cubrir y proteger los pocillos adicionales de la radiación mientras los otros pocillos están expuestos a una dosis de radiación particular. De lo contrario, use placas o discos individuales para ver los embriones por dosis de radiación. Encienda la máquina del irradiador de rayos X e inicie la inicialización y el calentamiento de la máquina.
Coloque la placa experimental debajo del irradiador dentro de la máquina en el centro, asegurándose de que la placa esté directamente debajo de la fuente de rayos X. Y luego ajuste la dosis y comience la radiografía. Después de completar la irradiación, saque las placas, apague el programa de la máquina, apague la máquina y revise las placas bajo el microscopio inmediatamente después de la radiación.
Retire los embriones muertos y registre su número después de evaluarlos bajo el microscopio de disección. Regrese las placas a la incubadora a 28,5 grados centígrados. Recopile datos a intervalos de tiempo predeterminados después de administrar la radiación.
Registre todas las observaciones posibles, como la supervivencia, la eficiencia de la eclosión, la etapa de desarrollo, el recuento de latidos cardíacos, la curvatura del cuerpo y la cola, el edema pericárdico y la extensión del saco vitelino, la microcefalia, el desarrollo de la vejiga natatoria, la motilidad o actividad general, etc. Para capturar imágenes, elija embriones representativos en un portaobjetos limpio. Revisa los embriones bajo el microscopio, oriéntalos en una dirección particular.
La curva de supervivencia de los embriones irradiados a las seis horas después de la fecundación mostró que en el grupo control y en los embriones expuestos a 2 gray y 5 gray, no hubo muerte significativa en los embriones. El recuento de latidos cardíacos por minuto sugirió que la frecuencia cardíaca disminuyó enormemente con el aumento de las dosis de radiación de rayos X. En el grupo de control, en cada intervalo de 24 horas, se observó que la frecuencia cardíaca aumentaba.
Se sospecha una deformación cardiovascular severa en embriones expuestos a radiación de 15 gray y 20 gray a medida que los latidos del corazón disminuyeron enormemente. Se describen y evalúan diferentes defectos fenotípicos y de desarrollo para embriones expuestos a diferentes dosis de radiación en diferentes momentos. También se realizaron observaciones morfológicas de flexión de la columna vertebral o de la cola, malformación de la cabeza y microcefalia, defectos en el desarrollo, edema pericárdico, deformidades del saco vitelino, deformidades de la vejiga natatoria y cambios en la estructura ocular Para el protocolo que hemos demostrado, la elección de embriones sanos, la colocación adecuada de los embriones en el irradiador y la evaluación adecuada de las anomalías cruzadas son la clave de este procedimiento.
