Este protocolo descreve os passos detalhados para o uso de embriões de peixe-zebra para experimentos de triagem baseados em radiação e algumas abordagens observacionais para avaliar o tratamento de diferentes drogas e radiação. Isso ajudará os leitores a definir uma triagem de drogas de rendimento semi-alto envolvendo exposição a raios-X usando embriões de peixe-zebra, que guiará na avaliação da radiotoxicidade e da eficácia de diferentes drogas usadas. Este procedimento pode ser usado para triar, validar ou avaliar diferentes drogas como potenciais radiossensibilizadores ou protetores, que podem ser mais explorados ou usados no campo da radioterapia ou radiobiologia do câncer.
Para começar, monitore os embriões em crescimento sob o microscópio de dissecação. Identificar o estágio adequado e remover quaisquer embriões mortos ou insalubres. Garantir o estadiamento embrionário adequado é a radiação e as doses de drogas serão dadas em um estágio específico de gastrulação.
Antes de iniciar o experimento, distribua cuidadosamente os embriões saudáveis nas placas experimentais com a ajuda de uma pipeta de Pasteur. Para cada grupo experimental, tomar de 15 a 20 embriões. Ao montar um experimento de radiação, inclua um grupo controle não irradiado e um grupo somente de radiação.
Distribua os embriões em uma placa de poço se os escudos de radiação puderem cobrir e proteger os poços extras da radiação enquanto os outros poços são expostos a uma dose de radiação específica. Caso contrário, use placas ou discos individuais para ver os embriões por dose de radiação. Ligue a máquina irradiadora de raios X e inicie a inicialização e o aquecimento da máquina.
Coloque a placa experimental sob o irradiador dentro da máquina no centro, garantindo que a placa esteja diretamente abaixo da fonte de raios X. E, em seguida, definir a dose e iniciar o raio-x. Após a conclusão da irradiação, retire as placas, desligue o programa da máquina, desligue a máquina e verifique as placas sob o microscópio imediatamente após a radiação.
Remover os embriões mortos e registrar seu número após avaliá-los ao microscópio dissecante. Retorne as placas para a incubadora a 28,5 graus Celsius. Coletar dados em intervalos de tempo pré-determinados após a radiação ser administrada.
Registre todas as observações possíveis, como sobrevivência, eficiência de eclosão, estágio de desenvolvimento, contagem de batimentos cardíacos, curvatura do corpo e da cauda, edema pericárdico e extensão do saco vitelino, microcefalia, desenvolvimento da bexiga natatória, motilidade ou atividade geral, etc. Para capturar imagens, escolha embriões representativos em uma lâmina limpa. Verifique os embriões sob o microscópio, oriente-os em uma direção específica.
A curva de sobrevivência dos embriões irradiados seis horas pós-fertilização mostrou que no grupo controle e nos embriões expostos a 2 cinzas e 5 cinzas, não houve morte significativa nos embriões. A contagem de batimentos cardíacos por minuto sugeriu que a frequência cardíaca diminuiu enormemente com o aumento das doses de radiação de raios-X. No grupo controle, a cada intervalo de 24 horas, observou-se aumento da frequência cardíaca.
Suspeita-se de deformação cardiovascular grave em embriões expostos a 15 cinzas e 20 cinzas, pois os batimentos cardíacos caíram enormemente. Diferentes defeitos fenotípicos e de desenvolvimento são descritos e avaliados para embriões expostos a doses variáveis de radiação em diferentes momentos. Observações morfológicas para flexão da coluna ou cauda, malformação da cabeça e microcefalia, defeitos no desenvolvimento, edema pericárdico, deformidades do saco vitelino, deformidades da bexiga natatória e alterações na estrutura ocular também foram realizadas Para o protocolo que demonstramos, a escolha de embriões saudáveis, a colocação adequada dos embriões no irradiador e a avaliação adequada das anormalidades cruzadas são a chave para este procedimento.
