Este método permite la visualización del cerebro del pez cebra en etapas larvales posteriores para permitir la observación de la arquitectura neuronal de una manera altamente detallada in vivo que antes no era posible. Las células pigmentarias, que surgieron durante el desarrollo larvario posterior e impiden que el cerebro se contaja las imágenes claras, no son un problema con este método porque simplemente se eliminan. Con el método, debería ser posible estudiar los procesos que ocurren en etapas posteriores durante el desarrollo larvario del cerebro, los procesos que impactan en la plasticidad sináptica, la degeneración de las neuronas o su regeneración.
Antes de comenzar el experimento, use un extracdor de micropipetas para preparar agujas de vidrio afiladas y delgadas a partir de capilares de vidrio. A continuación, use una pipeta Pasteur de plástico para recolectar la larva en una placa de Petri de 90 milímetros de diámetro que contenga la solución adecuada. Transfiera la larva seleccionada a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro que contenga ACSF y coloque un deslizamiento de vidrio cuadrado de 24 por 24 milímetros en la tapa de la placa de Petri.
Luego, alícute el volumen de ACSF necesario para el experimento en un frasco apropiado para la oxigenación con carbógeno. Para incrustar la larva, use una pipeta Pasteur para transferir la larva anestesiada a una cámara de montaje debajo de un estereomitroscopio. Si alguna larva aún puede moverse, no use el pez para el experimento hasta que los peces sean completamente incapaces de moverse.
Cuando la larva esté inmóvil, retire cuidadosamente el exceso de medio e inmediatamente agregue al menos un mililitro de agarosa de baja fusión sobre la larva. Oriente el pez cebra con la región dorsal mirando hacia arriba lo más cerca posible de la superficie de la agarosa. Si la larva será fotografiada usando un microscopio invertido, después de una solidificación, recorte la agarosa que contiene la larva en un pequeño bloque cuboide.
Para exponer el cerebro para obtener imágenes, recorte el exceso de agarosa sobre la región cerebral de interés según sea necesario y use una aguja de vidrio para hacer una pequeña incisión a través de la piel cerca, pero no sobre, la región de interés sin penetrar demasiado profundamente en el tejido. Apenas moviendo la aguja justo debajo de la superficie de la piel, continúe haciendo cortes muy pequeños con cuidado alrededor de la región de interés hasta que la piel sobre la región de interés pueda ser removida o apartada. Cuando el tejido se haya extraído de todos los embriones, agregue una pequeña gota de agarosa de baja fusión a la cámara de imágenes previamente preparada de un microscopio invertido y use una pequeña espátula para voltear el bloque de agarosa cuboide 180 grados sobre la gota de agarosa en la cámara de imágenes.
Cuando la agarosa se haya solidificado, llene la cámara de imágenes con ACSF fresco y comience a obtener imágenes de la larva. Aquí, se puede observar una larva transgénica intacta 14 días después de la fertilización con el cráneo aún intacto. Como se muestra, las células pigmentarias dentro de la piel superpuesta se distribuyen por toda la cabeza, interfiriendo con la señal fluorescente en la región de interés.
Después de la cirugía de cráneo abierta, el área de interés se vuelve de libre acceso para obtener imágenes detalladas de alta resolución. La piel, el cráneo y/o la barrera hematoencefálica también dificultan la penetración de sustancias en el cerebro, como lo ilustra la robusta tinción de tinte nuclear observada en estas células cerebrales solo después de la cirugía de cráneo abierto. Estas ventajas también se observan a los 30 días después de la fertilización.
En peces transgénicos que contienen una vasculatura cerebral fluorescente debido a la expresión de la proteína fluorescente roja, mCherry, en células endoteliales, la codificación por colores en los valores de profundidad de la pila de imágenes demuestra que incluso los vasos sanguíneos profundamente enterrados dentro del cerebro a casi 250 micras todavía son claramente visibles y rastreables. Al realizar este procedimiento siempre tenga en cuenta que se trata de una cirugía en un animal vivo. Por lo tanto, requiere respeto y una mente enfocada.
Después de este procedimiento, el registro de la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas, los eventos fisiológicos y de transporte intracelular se puede realizar en larvas mayores de siete días después de la fertilización. Con esta técnica, esperamos proporcionar un enfoque que permita estudiar también los procesos celulares en el cerebro que ocurren en etapas larvales posteriores, y que están involucrados en el establecimiento, por ejemplo, de comportamientos tan complejos como el comportamiento social o la toma de decisiones.
