Presentamos un protocolo para preparar cultivos de rebanadas flotantes a partir de tejido cerebral recogido de donantes humanos vivos sometidos a cirugía cerebral resectiva. Este cultivo es susceptible de realizar ensayos bioquímicos y de biología celular o inmunohistoquímica. Se espera que contribuya a la esclareciación del mecanismo subyacente a la neurodegeneración en enfermedades cerebrales asociadas.
La principal ventaja de esta técnica es que es una alternativa más simple y rentable al protocolo de cultivo de rebanadas clásica utilizando inserciones de membrana. Aunque el protocolo general no es complejo, algunos pasos como la eliminación de meninges, el encolado del tejido al disco de la muestra de vibratoma y la resección para la inmunohistoquímica se entienden mejor cuando se demuestra visualmente. Ayudar a demostrar el procedimiento serán Niele Mendes y Glaucia Almedia, que son estudiantes de posgrado, y Giovanna Nogueira, otra estudiante de posgrado.
Para comenzar este procedimiento, agregue sal a un cubo de hielo. Transfiera la solución de corte a este cubo y déjela reposar bajo la mezcla de carbógeno burbujeando durante al menos 20 minutos antes de su uso. A continuación, preparar un bloque de 3% de agarosa que es de unos dos centímetros por dos centímetros por dos centímetros por dos centímetros.
Súper pegar el bloque de agarosa al disco de muestra de vibratoma con el fin de crear soporte mecánico adicional a la muestra de tejido durante el corte. En el vibratome, ajuste el espesor de la sección a 200 micrómetros, la frecuencia de vibración a 100 hercios, y elija una velocidad de corte entre 0,5 y 1,0 milímetros por segundo. A continuación, bloquee la bandeja de búfer de vibratomo en la base del vibratomo y agregue hielo para mantenerla refrigerada antes de recibir la solución de corte y la muestra y durante todo el procedimiento de corte.
En primer lugar, configure un aparato de transporte que consista en un cilindro de gas portátil que contenga una mezcla de carbógeno conectada a una válvula de flujo de presión que controle la salida de gas conectada a un tubo de silicona que conecte esa salida de gas con el buque de transporte y el buque de transporte que contiene la solución de transporte y el hielo para el enfriamiento de la muestra durante el transporte. Recoger y transportar el espécimen y el transporte como se describe en el protocolo de texto. Transfiera el espécimen a un plato de Petri que contenga solución de corte.
Usando herramientas quirúrgicas finas, retire cuidadosamente la mayor cantidad de meninges restantes como sea posible. Elija la mejor orientación de la muestra para la producción de rodajas con las características particulares del diseño experimental y utilice una hoja de bisturí número 24 para recortar una superficie plana para ser la base que se pegará al disco de la muestra. Usando una cuchara de plástico de eliminación y pinceles delicados, recoja el fragmento de la placa Petri y seque el exceso de solución con papel de filtro.
A continuación, utilice súper pegamento para unir el tejido al plato de la muestra de vibratoma hasta que se adhiera firmemente al plato y en contacto con el bloque de agarosa. Coloque el disco de muestra de vibratomo en la bandeja de búfer del vibratomo. Fije el portacuchillas en su lugar con la cuchilla de afeitar firmemente fijada.
Agregue la solución de corte y asegúrese de que está cubriendo tanto la muestra como la hoja. A continuación, comience a cortar la muestra en rodajas de 200 micrómetros. Transfiera las rodajas de la bandeja tampón a una placa de Petri que contenga solución de corte y recorte los bordes sueltos y el exceso de materia blanca a una proporción de aproximadamente 70% de corteza y 30% de materia blanca.
En un armario de flujo laminar, agregue 600 microlitros de medio de cultivo a cada pozo de una placa de 24 pozos e incubar a 36 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos antes de enchapar las rodajas. Después de esto, usa un pincel para planchar una rebanada en cada pozo. Si hay pozos no utilizados en la placa, llénelos con 400 microlitros de agua estéril.
Incubar a 36 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Suplemento 10 mililitros del medio de cultivo previamente preparado con factor neurotrófico derivado del cerebro a una concentración de 50 nanogramos por mililitro. Después de ocho a 16 horas, retire 333 microlitros del medio acondicionado de cada pozo y agregue 133 microlitros de medios frescos suplementados con BDNF.
Sustituya un tercio del medio acondicionado por un medio fresco suplementado con BDNF cada 24 horas. En primer lugar, transfiera las rodajas de los pozos que contienen el medio de cultivo a una nueva placa de 24 pozos que contenga PBS. Retire el PBS de cada pozo y reemplácelo por un mililitro de 4%paraformaldehído.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire cuidadosamente el paraformaldehído de los pozos y reemplácelo por un mililitro de solución de sacarosa al 30%. Incubar a cuatro grados centígrados durante 48 horas.
Después de 48 horas, ajuste el microtoma de congelación a 40 grados Celsius negativos. Preparar una base de sacarosa en la etapa de microtomo donde se deben colocar las rodajas. Después de que se congela por completo, cortar parte de la sacarosa congelada para producir una superficie plana en la que se colocará la rebanada.
A continuación, coloque cada rebanada sobre una película de plástico estirada y use un pincel para aplanar el tejido. En un solo movimiento, transfiera la rebanada estirada a la base de sacarosa congelada. Después de que la rebanada haya descansado durante cinco a 10 minutos para congelarse correctamente, corte la rebanada en secciones de 30 micrómetros.
Transfiera las secciones de 30 micrómetros a un plato Petri que contenga PBS y proceda a un protocolo de histología adecuado para el diseño experimental. Al determinar la calidad y la salud de las rebanadas cultivadas, un aspecto crítico a evaluar es la presencia y morfología típica de los tipos de células neuronales, neuronas y células gliales esperados. La arquitectura típica de la laminación cortical humana se observa en una rebanada al día in vitro cuatro reveladas por inmunoetiquetado neuronal.
Además, también se observa la presencia esperada de microglia y astroglia. Estos resultados demuestran que la arquitectura tisular no se ve afectada significativamente ni por el procedimiento quirúrgico, el procesamiento de la muestra o por el período a corto plazo in vitro. La respuesta neuronal a la despolarización inducida por cloruro de potasio también se ha cuantificado en rodajas cultivadas siguiendo la fosforilación ERK.
Curiosamente, un claro aumento de la fosforilación ERK se observa en rodajas tratadas con cloruro de potasio al día in vitro cuatro. Finalmente, la respuesta de las rodajas al día in vitro cuatro a un desafío tóxico se evalúa con un conocido inductor de estrés oxidativo peróxido de hidrógeno. La exposición de las rodajas a 300 peróxidos de hidrógeno militrolares durante 24 horas condujo a una fuerte disminución en la reducción de MTT.
En conjunto, la muerte celular masiva observada en el día in vitro cinco rebanadas después del desafío del peróxido de hidrógeno y los resultados de despolarización inducida por cloruro de potasio indican la salud general preservada de las rebanadas en el día in vitro cuatro que responden a un estímulo tóxico como el estrés oxidativo. Este protocolo se dedica principalmente a estudios basados en ensayos que duran más de una semana, como la investigación de mecanismos moleculares de neurotoxicidad y neuroprotección por fármacos candidatos. Aunque este protocolo se dedica al uso de tejido cortical recogido de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico para la epilepsia del lóbulo temporal microrresistente, es probable que el tejido recogido de otras regiones o condiciones cerebrales también podría ser fuente para producir cultivos de rebanadas flotantes.
Cultivos de corte del cerebro humano adulto pueden ser clave para avanzar en nuestra comprensión de las neuropatologías humanas debido a su circuito celular único y maquinaria molecular carente de rebanadas producidas a partir de cerebros de roedores.
