Con una simple mezcla de ingredientes y superficies funcionalizadas, este protocolo recrea una función vital de las células, el movimiento impulsado por el ensamblaje de actina. Los mecanismos bioquímicos y biofísicos de la producción de fuerza se pueden evaluar variando la mezcla de ingredientes y las propiedades de la superficie funcionalizada. La principal ventaja de este protocolo es que se pueden comprar todos los ingredientes, por lo que no es necesaria la experiencia en la purificación de proteínas.
Esto permite a los no especialistas utilizar este sistema como una herramienta en su investigación. Este protocolo proporciona un módulo de enseñanza de nivel universitario, que brinda a los estudiantes experiencia práctica en la manipulación de proteínas y la observación de un sistema biológico autopreparado bajo el microscopio. Pueden controlar y variar los parámetros del sistema.
El análisis físico, como una ecuación de Langmuir, se puede ejecutar en trayectorias. Comience por resuspender las proteínas liofilizadas. Reúna el sólido en el fondo del tubo mediante centrifugación de proteínas en polvo a cuatro grados centígrados.
Luego agregue agua según las instrucciones del fabricante e incube en hielo durante al menos 15 minutos. Mezclar suavemente por pipeteo. Manténgalo en el hielo durante otros 15 minutos y mezcle nuevamente.
Recoja la solución en el fondo del tubo por centrifugación. Remezclar, y alícuota sobre hielo. Para despolimerizar los oligómeros de actina formados durante la liofilización y la congelación, diluya una alícuota de actina resuspendida ocho veces en G-buffer enriquecido con ATP adicional, DTT y actina marcada al 10%.
Deje que se despolimerice en hielo con una mezcla ocasional durante al menos unos días a una semana antes de medir la concentración de proteínas. Para medir las concentraciones de proteínas de proteínas resuspendidas, primero prepare una serie de dilución de BSA. Comience colocando tubos de dos mililitros y 1.5 mililitros en el estante como se describe en el manuscrito.
Llene un tubo cónico de 15 mililitros hasta la parte superior con Bradford Reagent y colóquelo en hielo. Tome 200 microlitros de Bradford Reagent y expulse de nuevo en el tubo cónico para humedecer la punta de la pipeta. Como la solución es viscosa, pipetear lentamente para permitir que la solución entre y dejar la punta completamente sin hacer burbujas.
Luego, con la punta prehúmeda, pipetear 200 microlitros de Bradford Reagent en cada uno de los tubos de 1,5 mililitros en el bastidor. Y devuelva el contenido restante del tubo cónico de 15 mililitros a la botella. Mida el agua en los tubos de dos mililitros de las filas uno, tres y cinco.
Prepare la serie de dilución de BSA diluyendo la solución madre de BSA calibrada como se describe en el manuscrito. Luego haga diluciones en serie transfiriendo 900 microlitros de cada solución al siguiente tubo. Agregue 800 microlitros de agua al tubo Bradford Reagent para el espacio en blanco y encienda el temporizador.
Mezcle 800 microlitros de cada estándar BSA con 200 microlitros de Bradford Reagent en los tubos preparados. Dentro de los cinco minutos posteriores a la mezcla con el reactivo Bradford o cada estándar en una cubeta desechable, lea la absorbancia a 600 nanómetros. Grafique los valores de absorbancia obtenidos en función de la concentración conocida de BSA y obtenga una correlación lineal con un valor R de 0,99.
En los tubos que contienen 2000 microlitros de agua, diluir suavemente las proteínas resolubilizadas como se describe en el manuscrito. Agregue inmediatamente 800 microlitros de cada solución al reactivo Bradford preparado y mezcle. Lea las absorbancias en el espectrofotómetro en cinco minutos.
Calcular las concentraciones de proteínas utilizando la curva estándar previamente construida. Para el recubrimiento de perlas, enfríe previamente la centrífuga a cuatro grados centígrados. Pipetear 50 microlitros de tampón Xb en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Mezcle bien la suspensión de perlas de 4,5 micrómetros de diámetro mediante vórtice y agregue nueve microlitros de la suspensión al tubo que contiene tampón Xb. Centrifugar las muestras a 20, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para cubrir las perlas, retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar las perlas y vuelva a suspender el pellet de perlas en 40 microlitros de dos SpVCA micromolares en tampón Xb pipeteando suavemente.
Ahora agite las cuentas en el bloque seco a 1000 RPM durante 20 minutos a 18 grados centígrados. A continuación, lave las perlas recubiertas por centrifugación. Extracción del sobrenadante y resuspensión de las perlas en 50 microlitros de Xb frío con 1% BSA.
Después de lavar las perlas, vuelva a suspender el pellet de perla recubierto en 120 microlitros de Xb frío, 1% BSA. Guarde este producto en hielo en un refrigerador o cámara frigorífica. Prepare la mezcla de reacción de motilidad como se describe en el manuscrito.
Mezcle rápidamente la reacción y encienda el temporizador. Detecte toda la mezcla de reacción de motilidad en un portaobjetos. Cúbralo con un cubreobjetos de 18 milímetros por 18 milímetros y selle el cubreobjetos con VALAP fundido con un pincel pequeño.
Para obtener velocidades de desplazamiento promedio para toda una población de cuentas, registre el contraste de fase o las imágenes fijas fluorescentes a lo largo del tiempo escaneando toda la diapositiva. Mide la longitud del cometa a mano y registra los valores. Traza la longitud del cometa frente al tiempo.
La pendiente del ajuste lineal es la velocidad de crecimiento promedio. Seleccione películas de lapso de tiempo en microscopía de contraste de fase para evaluar las velocidades de las cuentas individuales. Dependiendo de la velocidad de la cuenta y la resolución requerida, tome fotogramas cada 1 a 10 segundos.
Utilice la herramienta de seguimiento de cualquier programa de procesamiento de imágenes para obtener velocidades y trayectorias de cuentas. La mezcla de estándares BSA con Bradford Reagent da una solución con tonos azules graduados. Los valores de absorbancia se representan gráficamente frente a las concentraciones estándar de proteínas y la correlación lineal se utiliza para determinar las concentraciones de proteínas resuspendidas.
La mezcla de perlas codificadas por SPVCA y medio de motilidad que contiene proteína tapante conduce a la formación de nubes de actina en cuestión de minutos. La polarización de las nubes ocurre aproximadamente a los cinco minutos y la producción del cometa a los 15 a 20 minutos. Los cometas de actina continúan alargando durante muchas horas, pero no se mantiene una velocidad constante.
Por lo tanto, la motilidad de las cuentas se evalúa en una hora. La mezcla de motilidad con la proteína de tapado o gelsolin da a los cometas de una manera similar. Las nubes de actina se polarizaron para formar cometas en los primeros 20 minutos de reacción y los cometas se alargaron con el tiempo.
La evaluación de las longitudes de los cometas medidas a lo largo del tiempo se utiliza para calcular la velocidad de desplazamiento. En ausencia de actividad de tapado, se forman nubes de actina alrededor de las cuentas, pero la formación de cometas no ocurre. El manejo cuidadoso y el pipeteo de proteínas es esencial para el éxito de este procedimiento, no solo al hacer la mezcla de motilidad, sino también al medir las concentraciones de proteínas con el ensayo de Bradford.
La formación de cometas y las trayectorias de cuentas obtenidas con este protocolo permiten comprender el mecanismo físico del movimiento utilizando materia blanda y análisis de física estadística y experimentación biofísica, incluidas mediciones de fuerza y micromanipulación.
