Este protocolo permite la generación simple de redes de nanotubos lipídicos a gran escala en las que los nanotubos individuales muestran un comportamiento de separación de fase similar al de la vesícula madre. La ventaja clave de este enfoque es que cooptamos el trabajo realizado por los motores moleculares para autoensamblar los nanotubos lipídicos de una manera altamente paralela y sin intervención humana. Para configurar un ensayo de motilidad deslizante, primero, coloque tres juegos de tiras de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio a cinco milímetros de distancia.
Presione suavemente un trozo de cubierta sobre la cinta y agregue 30 microlitros de una solución de kinesina de un micromolar en la celda de flujo preparada. Después de cinco minutos, agregue 30 microlitros de una solución de microtúbulos de 10 microgramos / mililitros en la célula, presionando una toallita de laboratorio suavemente contra el extremo opuesto del canal de flujo para facilitar el intercambio de soluciones. Después de otra incubación de cinco minutos, lave la célula de una a tres veces con 50 microlitros de solución de motilidad a temperatura ambiente por lavado antes de agregar 30 microlitros de solución de estreptavidina de 10 microgramos / mililitro a la célula de flujo.
Después de 10 minutos, agregue 30 microlitros de una solución 10X GUV para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue dos microlitros de una solución AMP-PNP de 100 milimolares y cierre la cámara con sellador. Transfiera la cámara de flujo a un microscopio invertido para obtener imágenes y seleccione el conjunto de filtros adecuado.
Utilice un objetivo de aceite 100X para enfocar primero la superficie del resbalón de la cubierta antes de adquirir una imagen de una red de interés. A continuación, abra la imagen en ImageJ y haga clic en Imagen, Color y Compuesto para superponer los canales rojo y verde y crear una imagen compuesta. Después de obtener la imagen, abra la imagen de interés y haga clic en Analizar y establecer escala para calibrar la escala para el microscopio.
Rellene los píxeles hasta el factor de conversión de micrómetros y haga clic en Aceptar. Utilice la herramienta de línea multipunto para trazar los nanotubos a partir del GUV padre y mantenga pulsadas las teclas Control y M para medir la longitud. La herramienta de procesamiento de imágenes guardará cada nueva medición en la ventana de resultados. Cuando se hayan medido todos los tubos, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral y haga clic en Aplicar para aplicar el umbral.
Luego, dibuje un rectángulo de longitud conocida sobre el tubo deseado. Para medir la densidad integrada del área, haga clic en Analizar y medir Para determinar la partición de lípidos en los nodos de nanotubos líquidos, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea sobre el nodo de interés y mida la intensidad del nodo en los canales verde y rojo. En este análisis representativo, se fabricaron redes de nanotubos líquidos como se demostró para generar fases desordenadas y ordenadas por líquido, así como vesículas separadas por fases.
Por ejemplo, las vesículas sintetizadas con un 45% de lípidos saturados y un 55% de lípidos insaturados dan como resultado vesículas que se separan en fases líquidas y sólidas coexistentes. Sin embargo, si se incluye el colesterol, se puede observar la coexistencia líquido-líquido, creando GUV que se separan en fases coexistentes ordenadas por líquido y desordenadas por líquido. Además, se pueden observar nodos dentro de las mezclas separadas por fases.
Lo más importante a recordar es elegir el tiempo de exposición adecuado y el conjunto de filtros ND para poder visualizar los nanotubos lipídicos sin fotoblanquear los fluoróforos. Adaptar la composición del comportamiento de fase de los nanotubos lipídicos nos permite utilizar un sistema modelo minimalista para comenzar a estudiar la biofísica de los nanotubos de tunelización que conectan las células.
