La terapia fotodinámica, PDT, ofrece varias ventajas para el tratamiento del cáncer, y su eficacia depende de una fuente de luz para activar un fotosensibilizador. A pesar de los avances recientes en el campo, hay una falta de acceso a un dispositivo costoso y reproducible para PTD para modelos in vitro. Para lograr esta demanda, este trabajo describe un dispositivo novedoso, simple y de bajo costo para realizar ensayos PDT en cultivos celulares, llamado PhotoAct.
Para iniciar la construcción, sierra tableros de fibra de densidad media de tres milímetros de espesor, MDF, para obtener piezas con las siguientes dimensiones. Construye dos cajas con las siguientes dimensiones. Perfore la parte posterior de la caja más grande para instalar un conector de gato de barril.
También perfore la parte superior de la caja más grande, la parte superior e inferior de la caja más pequeña para proporcionar un paso para los cables eléctricos. Pinta todas las superficies internas con tinta negra para favorecer una incidencia homogénea de la luz. Coloque en paralelo tres cintas LED con 10 LED cada una en la superficie interior superior de la caja más pequeña.
Además, instale un sensor de brillo en el centro de la superficie interior inferior de la caja más pequeña. Imprima la estructura de la unidad de control utilizando el archivo de impresión 3D complementario. Instale todos los componentes, botón de encendido, potenciómetros, panel táctil de inicio de tiempo, LED, sensor de brillo, LCD, zumbador y fuente de alimentación, y las partes de una placa controladora ESP-32 montada en el interior de la unidad de control.
Cargue el código de programación disponible en el archivo complementario y ejecute una prueba para comprobar que todas las conexiones funcionan. Ensamble las cajas y fíjelas juntas para evitar huecos y, en consecuencia, interferencias de iluminación externa y pérdida inmediata de luz. Acople la unidad de control montada al área perforada en la parte superior del prototipo.
Construya una puerta frontal del mismo material en las siguientes dimensiones y fíjela en la caja exterior con bisagras y cintas de Velcro para garantizar el cierre de la cámara y ensayos ininterrumpidos. También instale una manija para manipular la puerta principal con facilidad y precisión. Coloque cuatro almohadillas de goma para los pies en la parte inferior del prototipo para garantizar una mayor estabilidad durante las operaciones.
Cultivar la línea celular HeLa en Eagle Medio bajo nivel de glucosa de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino y 1% de gentamicina. Mantener los frascos de cultivo al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Gestionar e inspeccionar el cultivo celular hasta alcanzar el 80 a 90% de confluencia.
Inicie el protocolo de viabilidad celular con el proceso de siembra. Retirar el medio del matraz con cultivo de células HeLa confluentes. Lavar el matraz con solución salina tampón fosfato, PBS, y separar el cultivo con tripsina siguiendo los detalles resaltados.
Cuente las células de resuspensión con un hemocitómetro y siembrarlas en una microplaca de múltiples pocillos a una concentración de 20, 000 células por pocillo. Prepare dos placas para condiciones de tratamiento oscuras y claras e incubarlas durante 24 horas para la unión celular. Para proceder con el tratamiento con un fotosensibilizador, retire el medio de ambas placas y trate las células con 100 microlitros de concentraciones crecientes de verteporfina.
Mantenga las células en tratamiento durante 24 horas para permitir la internalización de verteporfina. Después de la incubación, retire el tratamiento, lave las células con PBS y agregue un medio libre de medicamentos. Cubra una microplaca con papel de aluminio para protegerla de la exposición a la luz e incube durante 24 horas.
Esta microplaca ofrecerá datos de control para un análisis posterior de los resultados de PDT. La otra microplaca se utilizará en condiciones de exposición a la luz en el PhotoAct. Para operar el equipo, conéctelo a la toma de corriente y enciéndalo, presionando el botón de encendido.
Coloque la microplaca multipocillo en la cámara PDT y cierre el equipo sujetando la puerta frontal con las cintas laterales Velcro. Para configurar el equipo, utilice los potenciómetros para ajustar la configuración RGB de la emisión de luz. Pulse el panel táctil más/menos para ajustar la configuración de la hora y establecer la duración del ensayo.
Compruebe si se muestra la información correcta sobre el ensayo en la pantalla y realice los ajustes finales si es necesario. Presione el panel táctil de inicio para iniciar el ensayo. Se debe escuchar un pitido al comienzo del experimento.
Durante el experimento, se puede observar información de progreso en la pantalla, como la irradiancia y el tiempo restante. No abra la puerta principal ni cambie ninguna configuración durante el ensayo PDT. Al final del ensayo, se debe escuchar un zumbador de cuatro pitidos y el sistema electrónico apagará todos los LED.
Un mensaje terminado y la cantidad final de energía expandida durante el experimento se pueden observar en la pantalla. El valor final de fluencia se calcula de acuerdo con la ecuación resaltada. Cubra la microplaca que sufrió exposición a la luz y proceda con la incubación de 24 horas.
Después del período de incubación, retire el medio de ambas placas, lave la monocapa de células con PBS y agregue la solución MTT. Incubar ambas placas en condiciones oscuras y claras durante cuatro horas para permitir la formación de cristales de formazan. Retire la solución MTT con cuidado y disuelva los cristales púrpuras con una solución de DMSO y etanol.
Después de la disolución completa de los cristales, realice la medición de absorbancia utilizando un lector de microplacas a 595 nanómetros. El producto final consiste en una cámara oscura con su superficie interior superior equipada con un conjunto de 30 diodos emisores de luz dispersa, LED, programados para emitir distintos espectros de luz visible. Se establece una incidencia lumínica homogénea debido a la baja reflectividad de las superficies interiores y la distribución uniforme de la configuración de los LEDs.
La interfaz de configuración es fácil de usar y la condición experimental establecida era reproducible. Como prueba de concepto, el dispositivo se utilizó para mejorar el efecto citotóxico de verteporfina en cultivo celular HeLa 2D después de la exposición a la luz. Como se muestra en la figura, el valor GI50 fue de 3,1 micromolar para la condición de luz.
y 13,8 micromolares para la condición oscura Por lo tanto, el aumento de más de cuatro veces en la eficiencia comparando las condiciones confirma el uso de verteporfina como fotosensibilizador y la aplicabilidad de PhotoAct en ensayos PDT. Para validar el uso del prototipo descrito en este trabajo, se utilizó un dispositivo PDT comercial bajo las mismas condiciones experimentales, incluyendo fotosensibilizador, células y fluencia, y se compararon los resultados. Como se muestra en la figura, ambos dispositivos fotoactivaron Verteporfin por igual, potenciando el efecto citotóxico.
Finalmente, la muerte celular mediada por ROS desencadenada por verteporfina después de la exposición a la luz se confirmó mediante citometría de flujo utilizando el ensayo DCFDA. En resumen, el dispositivo se construyó fácilmente con componentes de bajo costo disponibles comercialmente con un costo total de menos de 50. Las principales ventajas del dispositivo incluyen portabilidad, baja demanda de mantenimiento, capacidad para irradiar múltiples tipos de placas de cultivo, el uso simultáneo de hasta cuatro unidades por ensayo, irradiación precisa y reproducible, interfaz de configuración fácil de usar y simple que no requiere conexión a computadoras u otras máquinas.
Además, se presenta un diagrama de flujo de decisión para proporcionar un enfoque sistemático de resolución de problemas para encontrar y corregir problemas o errores durante la operación. Estos hallazgos permiten extender los beneficios de PhotoAct para facilitar la TFD a la investigación científica, explorando el mecanismo de acción de los fotosensibilizadores y sus aplicaciones clínicas.
