טיפול פוטודינמי, PDT, מציע מספר יתרונות לטיפול בסרטן, ויעילותו תלויה במקור אור להפעלת פוטוסנסיטייזר. למרות ההתקדמות האחרונה בתחום, קיים חוסר גישה למכשיר יקר וניתן לשחזור עבור PTD עבור דגמי מבחנה. על מנת להשיג דרישה זו, עבודה זו מתארת מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע בדיקות PDT על תרביות תאים, בשם PhotoAct.
כדי להתחיל את הבנייה, ראה שלושה מילימטרים עובי לוחות סיבים בצפיפות בינונית, MDF, כדי לקבל חתיכות עם הממדים הבאים. בנה שתי תיבות עם הממדים הבאים. קדח את גב הקופסה הגדולה יותר כדי להתקין מחבר לשקע חבית.
קדחו גם את החלק העליון של הקופסה הגדולה יותר, את החלק העליון והתחתון של הקופסה הקטנה יותר כדי לספק מעבר לכבלי חשמל. צבעו את כל המשטחים הפנימיים בדיו שחור כדי לקדם שכיחות אור הומוגנית. חברו במקביל שלוש קלטות LED עם 10 נוריות LED כל אחת במשטח הפנימי העליון של הקופסה הקטנה יותר.
בנוסף, התקן חיישן בהירות במרכז המשטח הפנימי התחתון של הקופסה הקטנה יותר. הדפס את המבנה של יחידת הבקרה באמצעות קובץ ההדפסה התלת-ממדי המשלים. התקן את כל הרכיבים, לחצן ההפעלה, הפוטנציומטרים, לוח המגע של זמן ההתחלה, נוריות LED, חיישן בהירות, LCD, זמזם וספק כוח, ואת החלקים של לוח בקר ESP-32 המותקנים בתא הבקרה של יחידת הבקרה.
העלה את קוד התכנות הזמין בקובץ המשלים והפעל בדיקה כדי לבדוק שכל החיבורים פועלים. הרכיבו את הקופסאות וקבעו אותן יחד כדי למנוע פערים וכתוצאה מכך הפרעות תאורה חיצוניות ואובדן אור מיידי. חבר את יחידת הבקרה המותקנת לאזור הקדוח בחלק העליון של אב הטיפוס.
בנה דלת כניסה מאותו חומר במידות הבאות, ותקן אותה על הקופסה החיצונית עם צירים וקלטות סקוטש כדי להבטיח סגירת תא ומבחנים ללא הפרעה. התקינו גם ידית למניפולציה של דלת הכניסה בקלות ובדייקנות. חברו ארבע רפידות גומי לרגליים בתחתית אב הטיפוס כדי להבטיח יציבות רבה יותר במהלך הפעולות.
טפחו את קו תאי HeLa בגלוקוז הבינוני הבינוני המהונדס של דולבקו עם 10% מסרום בקר עוברי ו-1% גנטמיצין. שמור את צלוחיות התרבית על 5% של פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס. נהל ובדוק את תרבית התאים עד שתגיע ל-80% עד 90% מהמפגש.
התחל את פרוטוקול כדאיות התא עם תהליך הזריעה. הסר את המדיום מן הבקבוקון עם תרבית תאי HeLa confluent. שטפו את הבקבוקון עם מלח חיץ פוספט, PBS, ונתקו את התרבית עם טריפסין בעקבות הפרטים המודגשים.
לספור את התאים resuce עם hemocytometer ולזרוע אותם לתוך microplate מרובה היטב בריכוז של 20, 000 תאים לכל באר. הכינו שתי צלחות לטיפול בתנאים חשוכים ובהירים ודגרה שלהן למשך 24 שעות לחיבור התא. כדי להמשיך בטיפול עם photoensitizer, להסיר את המדיום משתי הצלחות ולטפל בתאים עם 100 microliters של ריכוזים הולכים וגדלים של Verteporfin.
שמור את התאים בטיפול במשך 24 שעות כדי לאפשר הפנמה Verteporfin. לאחר הדגירה, להסיר את הטיפול, לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף מדיום ללא תרופות. מכסים מיקרו-פלטה אחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני חשיפה לאור ולדגור עליה למשך 24 שעות.
לוח מיקרו זה יציע נתוני בקרה לניתוח נוסף של תוצאות PDT. המיקרו-פלטה האחרת תשמש בתנאי חשיפה לאור ב-PhotoAct. כדי להפעיל את הציוד, חבר אותו לשקע והפעל אותו, תוך לחיצה על לחצן ההפעלה.
הנח את המיקרו-פלטה מרובת הבארות בתא PDT וסגור את הציוד על ידי הידוק הדלת הקדמית עם קלטות הסקוטש הצדדיות. כדי להגדיר את הציוד, השתמש בפוטנציומטרים כדי להתאים את תצורת RGB של פליטת אור. לחץ על משטח המגע פלוס/מינוס כדי להתאים את תצורת הזמן ולהגדיר את משך הבדיקה.
בדוק אם המידע הנכון על הבדיקה מוצג בתצוגה ובצע התאמות סופיות במידת הצורך. לחץ על לוח המגע של הפעל כדי ליזום את הבדיקה. זמזם של צפצוף אחד חייב להישמע בתחילת הניסוי.
במהלך הניסוי ניתן לצפות במידע על ההתקדמות בתצוגה, כגון הקרנה והזמן שנותר. אל תפתח את דלת הכניסה ואל תשנה תצורה כלשהי במהלך בדיקת PDT. בסוף הבדיקה יש לשמוע זמזם של ארבעה צפצופים והמערכת האלקטרונית תכבה את כל נוריות ה- LED.
הודעה מוגמרת וכמות האנרגיה הסופית שהורחבה במהלך הניסוי ניתן לראות בתצוגה. הערך הסופי של השטף מחושב על פי המשוואה המסומנת. כסו את המיקרו-פלטה שסבלה מחשיפה לאור והמשיכו עם הדגירה של 24 שעות.
לאחר תקופת הדגירה, להסיר מדיום משתי הצלחות, לשטוף את monolayer של תאים עם PBS, ולהוסיף תמיסת MTT. יש לדגום את שני הלוחות בתנאים כהים ובהירים במשך ארבע שעות כדי לאפשר היווצרות גבישי פורמזאן. הסר את תמיסת MTT בזהירות והמיס את הגבישים הסגולים בתמיסת DMSO ואתנול.
לאחר פירוק גבישים מלא, בצע את מדידת הספיגה באמצעות קורא microplate בגודל 595 ננומטר. המוצר הסופי מורכב מתא כהה עם משטח פנימי עליון המצויד במערך של 30 דיודות פולטות אור מפוזרות, נוריות LED, המתוכנתות לפלוט ספקטרום שונה של אור נראה. שכיחות אור הומוגנית נקבעת עקב רפלקטיביות נמוכה של משטחים פנימיים והתפלגות אחידה של תצורת נורות LED.
ממשק ההתקנה ידידותי למשתמש ומצב הניסוי שהוסדר היה ניתן לשחזור. כהוכחת היתכנות, המכשיר שימש להגברת ההשפעה הציטוטוקסית של ורטפורפין בתרבית תאי HeLa דו-ממדית לאחר חשיפה לאור. כפי שניתן לראות באיור, ערך GI50 היה 3.1 מיקרומולר עבור מצב האור.
ו 13.8 micromolar עבור המצב הכהה לכן, העלייה של יותר מפי ארבעה ביעילות השוואת התנאים מאשרת את השימוש Verteporfin כמו photoensitizer ואת התחולה של PhotoAct על מבחני PDT. כדי לאמת את השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו, נעשה שימוש במכשיר PDT מסחרי באותם תנאי ניסוי, כולל פוטו-סנסיטייזר, תאים ופלואנס, והתוצאות הושוו. כפי שניתן לראות באיור, שני המכשירים ביצעו פוטו-אקטיביזציה של ורטפורפין באופן שווה, מה ששיפר את האפקט הציטוטוקסי.
לבסוף, מוות תאי בתיווך ROS שנגרם על ידי ורטפורפין לאחר חשיפה לאור אושר על ידי ציטומטריה של זרימה באמצעות בדיקת DCFDA. לסיכום, המכשיר נבנה בקלות עם רכיבים בעלות נמוכה הזמינים מסחרית בעלות כוללת של פחות מ -50. היתרון העיקרי הנוסף של המכשיר כולל ניידות, דרישת תחזוקה נמוכה, יכולת להקרין סוגים מרובים של לוחות תרבות, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, הקרנה מדויקת וניתנת לשחזור, ממשק התקנה ידידותי למשתמש ופשוט שאינו דורש חיבור למחשבים או למכונות אחרות.
בנוסף, תרשים זרימת החלטה מוצג כדי לספק גישה שיטתית לפתרון בעיות כדי למצוא ולתקן בעיות או שגיאות במהלך הפעולה. ממצאים אלה מאפשרים להרחיב את היתרונות של PhotoAct כדי להקל על PDT למחקר מדעי, לחקור את מנגנון הפעולה של פוטוסנסיטייזרים ואת היישומים הקליניים שלהם.
