Die photodynamische Therapie, PDT, bietet mehrere Vorteile für die Krebsbehandlung, und ihre Wirksamkeit hängt von einer Lichtquelle ab, um einen Photosensibilisator zu aktivieren. Trotz der jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet fehlt der Zugang zu einem teuren und reproduzierbaren Gerät für PTD für In-vitro-Modelle. Um diese Nachfrage zu erreichen, beschreibt diese Arbeit ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur Durchführung von PDT-Assays an Zellkulturen namens PhotoAct.
Um mit dem Bau zu beginnen, sägen drei Millimeter dicke mitteldichte Faserplatten, MDF, um Stücke mit den folgenden Abmessungen zu erhalten. Baue zwei Boxen mit den folgenden Abmessungen. Bohren Sie die Rückseite des größeren Kartons, um einen Zylinderanschluss zu installieren.
Bohren Sie auch die Oberseite der größeren Box, die Oberseite und die Unterseite der kleineren Box, um einen Durchgang für elektrische Kabel zu schaffen. Malen Sie alle Innenflächen mit schwarzer Tinte, um einen homogenen Lichteinfall zu fördern. Befestigen Sie parallel drei LED-Bänder mit je 10 LEDs an der oberen Innenfläche der kleineren Box.
Installieren Sie zusätzlich einen Helligkeitssensor in der Mitte der unteren Innenfläche der kleineren Box. Drucken Sie die Struktur der Steuereinheit mit der ergänzenden 3D-Druckdatei. Installieren Sie alle Komponenten, den Netzschalter, die Potentiometer, das Zeitstart-Touchpad, die LEDs, den Helligkeitssensor, das LCD, den Summer und das Netzteil sowie die Teile einer ESP-32-Controllerplatine, die im Inneren der Steuereinheit montiert sind.
Laden Sie den in der Zusatzdatei verfügbaren Programmiercode hoch, und führen Sie einen Test durch, um zu überprüfen, ob alle Verbindungen funktionieren. Montieren Sie die Boxen und befestigen Sie sie zusammen, um Lücken und damit externe Beleuchtungsstörungen und sofortigen Lichtverlust zu vermeiden. Befestigen Sie die montierte Steuereinheit an der Bohrfläche oben am Prototyp.
Bauen Sie eine Fronttür aus dem gleichen Material in den folgenden Abmessungen und befestigen Sie sie am äußeren Kasten mit Scharnieren und Velcro Bändern, um einen Kammerverschluss und ununterbrochene Assays zu gewährleisten. Installieren Sie auch einen Griff, um die Haustür mit Leichtigkeit und Präzision zu manipulieren. Befestigen Sie vier Gummifußpolster an der Unterseite des Prototyps, um mehr Stabilität während der Operationen zu gewährleisten.
Kultivieren Sie die HeLa-Zelllinie in Dulbeccos Modified Eagle Medium niedriger Glukose mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Gentamycin. Halten Sie die Kulturkolben bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Verwalten und inspizieren Sie die Zellkultur, bis 80 bis 90% des Zusammenflusses erreicht sind.
Starten Sie das Zelllebensfähigkeitsprotokoll mit dem Seeding-Prozess. Das Medium wird mit einer konfluierenden HeLa-Zellkultur aus dem Kolben genommen. Waschen Sie den Kolben mit Phosphatpuffersalzlösung, PBS, und lösen Sie die Kultur mit Trypsin nach hervorgehobenen Details.
Zählen Sie die Resuspendierungszellen mit einem Hämozytometer und säen Sie sie in eine Multi-Well-Mikroplatte mit einer Konzentration von 20.000 Zellen pro Well. Bereiten Sie zwei Platten für dunkle und helle Behandlungsbedingungen vor und inkubieren Sie sie für 24 Stunden zur Zellbefestigung. Um mit der Behandlung mit einem Photosensibilisator fortzufahren, entfernen Sie das Medium von beiden Platten und behandeln Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern steigender Konzentrationen von Verteporfin.
Halten Sie die Zellen für 24 Stunden in Behandlung, um die Internalisierung von Verteporfin zu ermöglichen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Behandlung, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie ein arzneimittelfreies Medium hinzu. Bedecken Sie eine Mikroplatte mit Aluminiumfolie, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen, und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang.
Diese Mikrotiterplatte wird Kontrolldaten für die weitere Analyse der PDT-Ergebnisse liefern. Die andere Mikrotiterplatte wird bei Lichtbelichtung am PhotoAct eingesetzt. Um das Gerät zu bedienen, schließen Sie es an die Steckdose an und schalten Sie es ein, indem Sie den Netzschalter drücken.
Platzieren Sie die Multiwell-Mikroplatte in der PDT-Kammer und schließen Sie das Gerät, indem Sie die Fronttür mit den seitlichen Velcro Bändern befestigen. Um das Gerät einzurichten, verwenden Sie die Potentiometer, um die RGB-Konfiguration der Lichtemission anzupassen. Drücken Sie das Plus/Minus-Touchpad, um die Zeitkonfiguration anzupassen und die Untersuchungsdauer einzustellen.
Überprüfen Sie, ob die richtigen Informationen über den Assay auf dem Display angezeigt werden, und nehmen Sie gegebenenfalls letzte Anpassungen vor. Drücken Sie das Start-Touchpad, um den Assay zu starten. Zu Beginn des Experiments muss ein One-Piep-Summer gehört werden.
Während des Experiments können Fortschrittsinformationen wie Bestrahlungsstärke und verbleibende Zeit am Display beobachtet werden. Öffnen Sie während des PDT-Tests nicht die Frontklappe und ändern Sie keine Konfiguration. Am Ende des Assays muss ein Vier-Piep-Summer gehört werden und das elektronische System schaltet alle LEDs aus.
Eine fertige Nachricht und die endgültige Energiemenge, die während des Experiments expandiert wurde, können am Display beobachtet werden. Der Fluence-Endwert wird gemäß der hervorgehobenen Gleichung berechnet. Decken Sie die Mikroplatte ab, die unter Lichteinwirkung litt, und fahren Sie mit der 24-Stunden-Inkubation fort.
Nach der Inkubationszeit das Medium von beiden Platten entfernen, die Monoschicht der Zellen mit PBS waschen und MTT-Lösung hinzufügen. Inkubieren Sie beide Platten unter dunklen und hellen Bedingungen für vier Stunden, um die Bildung von Formazankristallen zu ermöglichen. Entfernen Sie die MTT-Lösung vorsichtig und lösen Sie die violetten Kristalle mit einer DMSO- und Ethanollösung auf.
Nach vollständiger Auflösung der Kristalle wird die Absorptionsmessung mit einem Mikrotiterplattenleser bei 595 Nanometern durchgeführt. Das Endprodukt besteht aus einer dunklen Kammer, deren obere Innenfläche mit einem Satz von 30 Streulichtdioden (LEDs) ausgestattet ist, die so programmiert sind, dass sie unterschiedliche Spektren sichtbaren Lichts emittieren. Durch die geringe Reflektivität der Innenflächen und die gleichmäßige Verteilung der LED-Konfiguration wird ein homogener Lichteinfall hergestellt.
Die Aufbauoberfläche ist benutzerfreundlich und der festgelegte experimentelle Zustand war reproduzierbar. Als Proof of Concept wurde das Gerät verwendet, um die zytotoxische Wirkung von Verteporfin in 2D-HeLa-Zellkultur nach Lichtexposition zu verstärken. Wie in der Abbildung gezeigt, betrug der GI50-Wert 3,1 Mikromolar für die Lichtverhältnisse.
und 13,8 Mikromolar für den dunklen Zustand Daher bestätigt die Steigerung der Effizienz um mehr als das Vierfache im Vergleich der Bedingungen die Verwendung von Verteporfin als Photosensibilisator und die Anwendbarkeit von PhotoAct auf PDT-Assays. Um die Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Prototyps zu validieren, wurde ein kommerzielles PDT-Gerät unter den gleichen experimentellen Bedingungen verwendet, einschließlich Photosensibilisator, Zellen und Fluence, und die Ergebnisse wurden verglichen. Wie in der Abbildung gezeigt, photoaktivierten beide Geräte Verteporfin gleichermaßen, wodurch die zytotoxische Wirkung verstärkt wurde.
Schließlich wurde der ROS-vermittelte Zelltod, der durch Verteporfin nach Lichtexposition ausgelöst wurde, durch Durchflusszytometrie mit DCFDA-Assay bestätigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Gerät problemlos mit handelsüblichen kostengünstigen Komponenten mit Gesamtkosten von weniger als 50 gebaut werden konnte. Zu den wichtigsten weiteren Vorteilen des Geräts gehören Portabilität, geringer Wartungsaufwand, Fähigkeit, mehrere Arten von Kulturplatten zu bestrahlen, die gleichzeitige Verwendung von bis zu vier Einheiten pro Assay, genaue und reproduzierbare Bestrahlung, benutzerfreundliche und einfache Setup-Schnittstelle, die keine Verbindung zu Computern oder anderen Maschinen erfordert.
Darüber hinaus wird ein Entscheidungsflussdiagramm dargestellt, um einen systematischen Problemlösungsansatz zum Auffinden und Beheben von Problemen oder Fehlern während des Betriebs zu bieten. Diese Ergebnisse ermöglichen es, die Vorteile von PhotoAct zur Erleichterung der PDT auf die wissenschaftliche Forschung auszudehnen und den Wirkmechanismus von Photosensibilisatoren und ihre klinischen Anwendungen zu erforschen.
