Este estudio es un sistema simple, versátil y fácil para examinar diferentes efectos fotodinámicos en diversos microorganismos y células. En este sistema, el LED se puede encajar en diferentes disposiciones dependiendo del diseño del experimento. Se pueden calcular diferentes condiciones de PDT en una placa de 96 pocillos o incluso en una placa de 384 pocillos en un experimento.
Esta técnica se puede utilizar para tratar la queratitis fúngica debido a que a nivel mundial, alrededor de 150.000 personas pierden los ojos a pesar de los tratamientos intensivos. Para comenzar, corte cuatro LED verdes de una tira de LED y alinee con tres pocillos de una placa de 96 pocillos. Mida la velocidad de fluencia del LED a 540 nanómetros con un medidor de potencia de luz.
Mantenga la temperatura constante a 25 grados centígrados con un ventilador eléctrico que se ensambló junto a la placa durante la irradiación. Con un lazo estéril, elija una sola colonia de Candida albicans de una placa de agar y agréguela a un tubo de vidrio esterilizado que contenga tres mililitros de medio YPD. Incubar el tubo a 25 grados Centígrados a una velocidad de rotación de 155 RPM durante 14 a 16 horas para cultivar el cultivo de levadura.
A continuación, diluya el cultivo nocturno con YPD medio a un valor OD 600 de 0.5. Incubar a 30 grados centígrados con rotación a 155 RPM durante cuatro horas para lograr la fase de crecimiento logarítmico. Repetir la dilución del cultivo en fase logarítmica con medio YPD fresco a un valor de OD 600 de 0,65, para obtener aproximadamente una vez 10 a la séptima colonia formando unidades por mililitro.
Prepare simultáneamente una solución de 4% de stock de rosa de bengala en 1X PBS. Esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 micrómetros. Agregue 111 microlitros de solución de bengala de rosa al 2% a un mililitro de cultivo en fase logarítmica, y cocultivo en diferentes puntos de tiempo a temperatura ambiente para comprender la absorción de RB en las células.
Centrifugar a 16, 100 veces G durante 2 1/2 minutos a temperatura ambiente, y lavar el cocultivo tres veces con un mililitro de 1X PBS. Después del lavado, vuelva a suspender el cultivo de Candida albicans en un mililitro de 1X PBS. Para cada condición, distribuya el cultivo en tres pozos diferentes en una placa de 96 pocillos.
Alinee los pozos con la matriz de LED. En los grupos expuestos a la luz, encienda el ventilador eléctrico y la luz. Después de la irradiación, realice diluciones en serie diez veces dos veces tomando 20 microlitros de la solución de cocultivo de un pozo y agregándola a un tubo que contenga 180 microlitros de 1X PBS.
Luego deje caer 20 microlitros de cada dilución en serie en un cuadrante de una placa de agar YPD para obtener colonias contables en la placa. La microscopía fluorescente mostró tinción inmediata de Candida albicans con rosa de bengala bajo fluorescencia roja. Después de 15 minutos de incubación, la mayoría de las células se tiñeron con rosa de bengala, lo que indica que ingresa a las células de una manera dependiente del tiempo.
Además, la activación de la rosa de bengala con luz genera radicales libres y oxígeno singlete en las células, lo que resulta en la muerte celular. En ausencia de rosa de bengala o irradiación, no se observó muerte celular. Candida albicans se inhibió después de la irradiación de luz verde en presencia de 0,2% de bengala de rosa de una manera dependiente de la dosis de luz.
Es importante que primero la placa de 96 pocillos esté alineada con el centro del LED. En segundo lugar, la placa de agar utilizada debe secarse bien para evitar la mezcla de colonias separadas. La Candida albicans que creció en la placa se puede enviar para el análisis de genes, que puede responder cómo la PDT afecta la expresión génica de las células.
Estas técnicas allanan el camino para examinar cómo funciona la PDT en diferentes tipos de células, ya sean células cancerosas, bacterias, hongos o virus con una plataforma fácil, económica y versátil.
