Este protocolo in vitro, basado en placas de 96 pocillos, se puede utilizar para probar el efecto inhibitorio de los anticuerpos sobre nuevos agentes antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células fúngicas en biopelículas de Candida. En comparación con otros métodos, esta es una técnica altamente sensible, precisa, de alto rendimiento, reproducible, fácil de usar y rentable para evaluar el efecto de los anticuerpos o antifúngicos en el desarrollo de biopelículas de Candida. Este ensayo se puede utilizar para evaluar la eficacia de nuevas terapias basadas en fármacos o anticuerpos, así como candidatos a vacunas contra biopelículas de Candida, que están asociadas con la gravedad de la candidiasis invasiva.
Este método se puede aplicar para probar el efecto de nuevos agentes antifúngicos o anticuerpos durante la formación o maduración de biopelículas en diferentes entornos utilizando diferentes cepas de hongos o fuentes de anticuerpos. Demostrando este procedimiento estará el Sr. Pankaj Chandley, un investigador de doctorado que trabaja en mi laboratorio. Para comenzar, agregue 100 microlitros de cultivo de Candida tropicalis a una placa de microtitulación de 96 pocillos.
Con una pipeta multicanal, llene las dos últimas columnas con 100 microlitros de medio RPMI 1640 MOPS solo. Cubra la placa de microtitulación con una tapa y papel de aluminio e incube la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados en condiciones estacionarias. Al día siguiente, aspire el medio cuidadosamente con una pipeta multicanal.
Invierta la placa suavemente en las hojas secantes y toque para eliminar cualquier medio residual. Lave el plato con 200 microlitros de 1X PBS utilizando una pipeta multicanal. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal y lavar dos veces con PBS.
Para eliminar el exceso de PBS, seque al aire la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad biológica. Preparar diluciones seriadas de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI 1640 MOPS. Agregue 100 microlitros de la dilución sérica seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos.
En la columna 10, agregue solo el medio RPMI 1640 MOPS para el control positivo solo de hongos. Agregue una dilución de uno a 50 de suero a todos los pocillos en la columna 11 para que sirva como control negativo sin hongos más suero. Después de cubrir la placa con una tapa y papel de aluminio, incubar la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, después de aspirar el suero cuidadosamente con una pipeta multicanal, golpee suavemente la placa invertida para eliminar cualquier suero residual. Repita el lavado de PBS tres veces y seque al aire la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de seguridad biológica para secar cualquier exceso de PBS. Luego, disuelva 25 miligramos de XTT en 50 mililitros de lactato de Ringer esterilizado por filtro.
Alícuota 10 mililitros en tubos separados. Cúbralo con papel de aluminio y guárdelo a menos 80 grados centígrados. A continuación, disuelva 8.6 miligramos de menadiona en cinco mililitros de acetona.
Y después de distribuir 50 microlitros en 100 microtubos separados, guarde las alícuotas a menos 80 grados centígrados. Tome 10 mililitros de XTT y agregue un microlitro de menadiona para obtener una solución de trabajo de un micromolar. Agregue 100 microlitros de la solución de menadiona XTT por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos.
Luego, después de cubrir la placa con una tapa y papel de aluminio, incube la placa durante dos horas a 37 grados centígrados en la oscuridad. Finalmente, transfiera 80 microlitros del sobrenadante coloreado de cada pozo a una placa fresca de 96 pocillos y lea la placa a 490 nanómetros. El suero de ratones inmunizados con Sap2-parapsilosis podría prevenir la maduración de biopelículas preformadas de Candida tropicalis en un 65% en comparación con el 45% en suero de Sap2-albicans y el 55% en ratones inmunizados con Sap2-tropicalis.
En general, la inhibición de la biopelícula por el suero inmune Sap2 fue significativamente mayor que la del suero inmune simulado, que es del 16% y 13% en el suero preinmune. La inhibición de la biopelícula fue casi insignificante en el uso de PBS y ningún control sérico. Se debe tener el máximo cuidado al realizar los pasos de lavado para evitar la interrupción de las biopelículas.
La solución XTT debe prepararse justo antes de su uso y agregarse a la placa inmediatamente. Después de este procedimiento, los usuarios pueden evaluar el efecto de nuevos agentes antifúngicos, candidatos a vacunas o anticuerpos durante la formación y maduración de la biopelícula Candida en diferentes entornos de investigación utilizando diferentes cepas de hongos.
