Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del sur de Texas Gestión Tecnológica (POCrr 2009.041), el Instituto para la Integración de la Medicina y la Ciencia del Centro Nacional para Recursos de Investigación (UL 1RR025767), y del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial ( 5R21DE017294).

1. Preparación de las diapositivas funcionalizados <ol><li> Coloque los portaobjetos en un bastidor deslizante extraíble, y lavar dos veces por inmersión en una cubeta que contiene 99% de etanol (grado histológico). Limpie las diapositivas limpiar con toallas de papel (para asegurar que no genere polvo de papel), y seca con un chorro de gas nitrógeno comprimido. </li></ol> NOTA: No utilice paños de Kim-para eliminar las diapositivas, ya que podría generar el polvo de papel fino. <ol start="2"><li> Sumerja la parrilla corrediza que contiene las diapositivas en una cubeta llena de ácido sulfúrico concentrado y se incuban a temperatura ambiente durante la noche. </li></ol> NOTA: Para evitar el contacto con la piel, use guantes resistentes y gafas de seguridad mientras se trabaja con ácidos concentrados y productos químicos tóxicos y corrosivos. <ol start="3"><li> Soníquelos las diapositivas durante 30 min y lavado con agua Milli-Q (18 MW) de agua durante 30 minutos, siga con otro lavado en uncetona durante 5 min. Este tratamiento expone los grupos de silanol en la superficie del vidrio. </li><li> Cubrir las diapositivas limpias con 2,5% (vol / vol en agua) de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) solución, sumergiendo la rejilla deslizante en APTES durante 30 minutos, lavado 3 veces en agua Milli-Q durante 15 minutos cada lavado, y hornear las diapositivas en un horno a 110 ° C durante 15 min. Horneado permite la reticulación de los APTES, resultando en-NH2-funcionalización de la superficie. </li></ol> NOTA: Hacer la solución APTES en un recipiente de plástico ya que los depósitos APTES preferentemente en las paredes del recipiente de vidrio. <ol start="5"><li> Usando una revestidora de giro, recubrir las diapositivas con 1% (peso / volumen en tolueno) Poliestireno-co-anhídrido maleico (PS-MA) (Sigma) para lograr una mono-capa de revestimiento hidrófobo 6. Añadir 2,0 ml de PS-MA en un portaobjetos de vidrio limpio montado en una recubridora de rotación y la capa a 3.000 rpm durante 30 s. Estas condiciones pueden variar en función de los parámetros de recubrimiento por rotación, tales como revestimiento por lolución, el sustrato, el espesor de recubrimiento y se rige por la siguiente ecuación 7 </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> donde h es el espesor de recubrimiento de película, e es la tasa de evaporación, η, C y ρ son la viscosidad, la concentración y la densidad de la solución de revestimiento, respectivamente, y ω es la velocidad angular. NOTA: El tolueno es perjudicial cuando se inhala por un largo tiempo y el uso de una campana de humos se recomienda. <ol start="6"><li> Las diapositivas se pueden almacenar en un soporte de diapositivas para un máximo de un mes en lugares secos y libres de polvo las condiciones de temperatura de 2 - 8 ° C. </li></ol> 2. Preparación de los inóculos de levadura y la encapsulación de colágeno <ol><li> Preparar un cultivo de una noche de C. albicans cepa SC5314, en levadura peptona dextrosa [YPD; 10 g / L de extracto de levadura, peptona 20 g / L y 20 dextrosa g / l] medio líquido mediante la inoculación de una sola colonia de C. alalbicans en 10 a 20 ml de YPD 8. Incubar la cultura en un agitador orbital (alrededor de 150 a 200 rpm) a 30 ° C durante la noche. Cosecha 1 mL de Candida albicans de células de levadura durante la noche culturas YPD (por centrifugación a 5.000 rpm durante 5-10 minutos) y se lava dos veces durante 10 minutos en 1 ml de solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS; tampón fosfato 10 mM, 2,7 mM de cloruro de potasio, 137 mM de cloruro de sodio, pH 7,4) (Sigma) por lavado. Cosecha lavaron las células también por centrifugación a 1900 rpm durante 10 minutos. Resuspender las células lavadas en 1 ml de tampón de reconstrucción (0,2 N solución de NaOH con bicarbonato de sodio 2,2% (peso / vol) y 4,8% (peso / vol) de HEPES, pH 7,2). </li></ol> NOTA: C. albicans es un microorganismo del grupo de riesgo 1/BSL1. Recuerde siempre utilizar buenas técnicas de asepsia / estéril para trabajar con este microorganismo y seguir los procedimientos institucionales para la disposición apropiada de los materiales de riesgo biológico. <ol start="2"><li> Contar las células usando un hemocytOmeter en un microscopio de campo brillante y ajustarse a una densidad celular de 5 x 10 7 células / ml. </li><li> Además diluir la suspensión diez veces por adición de 10 x RPMI-1640 suplementado con L-glutamina y tamponado con morpholinepropanesulfonic (MOPS) de ácido (pH 7,2). </li><li> Encapsular las células de levadura en el colágeno mediante la mezcla de la suspensión de células en RPMI-1640 con colágeno (1,8 mg / ml) (Tipo 1 de cola de rata, BD Biosciences, Bedford, MA), para obtener una concentración final de 4 x 10 6 células / ml. Mantener la suspensión de colágeno de células en hielo para evitar la gelificación de colágeno antes de imprimir. </li></ol> 3. Preparación de Ca BChip <ol><li> Limpie y desinfecte todas las superficies del microarrayer, incluyendo la placa de la fuente emisora, el lavado y la estación de vacío, plato deslizante de vacío y la cámara de impresión, frotándolo con isopropanol al 70%. </li><li> Colocar y mantener al vacío el número deseado de portaobjetos de vidrio PS-MA-recubiertos en la cubierta deslizante del micrófonoroarrayer. </li><li> Vórtice de la suspensión de células de colágeno y aspirar con fuerza 100 L de la suspensión bien mezclada en un pocillo de una placa de 96 pocillos, justo antes de imprimir. Coloque este plato de origen en la estación de carga. </li><li> Conectar el humidificador para mantener una humedad relativa del 100% en la cámara de microarrays en todo el proceso de impresión. </li><li> Imprimir 50 º latitud norte de la suspensión de células en una matriz de 48 filas y 16 columnas con puntos espaciados 1,2 mm de distancia con un vigilante de microarrays (Omnigrid Micro, Digilab Inc., Holliston, MA) por el depósito sin contacto utilizando cónica consejos de orificio 190 micras de cerámica (Digilab). </li><li> Primer, enjuagar y secar al vacío-las puntas de dos veces después de cada ronda de la impresión. </li><li> Inmediatamente después de la impresión, coloque el portaobjetos en un espacio cerrado, cámara húmeda (cassette de hibridación, Arrayit Corporation, Sunnyvale, CA) y se incuba a 37 ° C durante 24 horas para permitir la formación de biopelículas. </li></ol> 4. Pruebas de sensibilidad de la Preformed biopelículas en Ca BChip contra los agentes antifúngicos <ol><li> Desde soluciones madre o polvo de fármacos antifúngicos, preparar una solución de trabajo en medio RPMI-1640. Las concentraciones típicas de máximos de la solución de trabajo son 1.024 mg / ml para fluconazol y 16 mg / ml para la anfotericina B 5. Otras concentraciones puede ser utilizado para diferentes agentes. </li><li> Preparar ocho diferentes concentraciones del compuesto mediante la dilución de la solución madre en dos diluciones, que abarca una gama con el estimado IC 50 del compuesto en el medio. </li><li> Después de 24 horas de formación de biopelículas, utilice el microarrayer para imprimir 50 º latitud norte de ocho diferentes concentraciones de los fármacos, junto con el positivo (es decir, no hay células de drogas en los medios de comunicación sólo) y negativo (tratamiento con hipoclorito de sodio durante 20 minutos) controles de, al menos en seis repeticiones en la parte superior de las biopelículas. </li></ol> NOTA: Mantener una humedad relativa del 100% para evitar el secado de las manchas mientras complementoIng las drogas. <ol start="4"><li> Poco después de la adición de las drogas, se incuba el chip con las drogas en una cámara húmeda a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Lavar las drogas fuera por mojar la CaBChip 3-5 veces durante 2 minutos cada vez en PBS y se tiñen mediante la incubación de la BChip Ca con 0,5 mM Fun1 a 37 ° C durante 30 min 9. </li><li> Lave la mancha por meter el BChip Ca 3-5 veces en PBS durante 1-3 min cada mate, y secar la BChip CA mediante una corriente de nitrógeno. Leer la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microarrays (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) a una longitud de onda de 532 nm con una ganancia de PMT 380. </li><li> Ajuste la intensidad de fluorescencia del control positivo (sin drogas) y muertos (lejía) tratados con manchas de biopelículas en 100% y 0%, respectivamente. </li><li> Determinar el porcentaje de inhibición por la reducción en la intensidad de fluorescencia (F) en relación con la media de los puntos de control utilizando la siguiente ecuación </li></ol><img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> donde F, F max y F son primas o la intensidad de fluorescencia de las drogas, el control no se trata de drogas y los puntos tratados con cloro, respectivamente. La configuración del escáner se ajusta para obtener F max y F o de 30000 y 4000 RFU, respectivamente. <ol start="9"><li> Calcular la concentración inhibitoria del 50% o IC 50 mediante el ajuste de la ecuación la variable pendiente de la colina con el software GraphPad Prism (La Jolla, CA). </li></ol> 5. Los resultados representativos Un representante de Ca BChip, que consiste en una matriz de 48 × 16 de la nano-biopelículas de C. albicans, se muestra en la Figura 2. La microscopía de campo claro muestra una característica general de arquitectura de la nano-bio-película. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido de la demostración de que la biopelícula hifas de los hongos están incrustados en la matriz defibras de colágeno, que son aproximadamente 2 micras y 100 nm de diámetro, respectivamente. Las imágenes de microarrays Fun1 manchadas de escáner muestran la levadura y las formas de hifas, que son característicos de las biopelículas fúngicas. Las imágenes de fluorescencia 2D-3D y confocal de Fun1-teñidos de biopelículas se puede ver que tienen heterogeneidad espacial, con las regiones de las células metabólicamente activas intercalados dentro de la matriz extracelular (compuesta de colágeno como el material de encapsulación y muy probablemente también de material producido por exopolimérica biofilm las células), que no está manchada por el colorante metabólico. El espesor de la biopelícula se estimó en aproximadamente 50 micras. El BChip Ca se utilizó para estimar la susceptibilidad antifúngica de dos fármacos, fluconazol y anfotericina B, y los resultados se muestran en la Figura 3. De acuerdo con informes publicados sobre el estándar de la industria 96-y los ensayos de placa, las biopelículas son resistentes a fluconazol 10 y el 50 para calcular IC<html> anfotericina B es de 0,3 mg / ml 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo para la fabricación de Ca BChip. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Figura 2. Una imagen de la BChip alta thoughput Ca, impreso con un microarrayer robótico y que contiene 768 puntos en PS-MA-revestida de diapositivas. Cada punto es semiesférica 50 nL en volumen, aproximadamente 700 micras de diámetro, y con una separación de 1,2 mm entre los puntos. También se muestra (a la derecha) son la microscopía de luz, lector de microarrays, la microscopía de 2D y 3D de fluorescencia, y escaneado de imágenes de microscopía electrónica de las biopelículas individuales en el BChip Ca. La cifra de SEM a gran aumento de 25.000 x muestra un filamento de hifas de 2 micras de ancho. Figura 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Los resultados de las pruebas de sensibilidad antifúngica y la determinación de valores de IC50 para (A) fluconazol y (B) con la anfotericina B Ca BChip. Las imágenes de microscopio de fluorescencia de anfotericina B tratados con biopelículas se muestran en (C). Los resultados son la media ± error estándar de la media de dos chips independientes que contienen 10 repeticiones para cada condición.

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	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

José L. López-Ribot y Anand K. capital Ramasubramanian propia en Tecnologías de la MicrobeHTS, Inc., que es el desarrollo de agentes antifúngicos. Tecnologías MicrobeHTS, Inc. no proporcionó apoyo financiero para estos estudios.

Hemos desarrollado una base de células de alta densidad de microarrays, Ca BChip, que consta de los volúmenes de nanolitros de Candida albicans biopelículas. El microarray fue impreso en el vidrio modificado sustratos, lo que permitió para la fijación sólida de los puntos de gel de colágeno mientras que proporciona hidrofobicidad necesaria para la no propagación de gel 3D hemisférica. Una sola BChip Ca puede reemplazar aproximadamente ocho placas de 96 pocillos, y varios chips se pued...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Poliestireno-co-anhídrido maleico (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Portaobjetos de vidrio de microscopía </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Cola de Rata colágeno tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robótica Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> Genepix personal 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> La hibridación de cassette </td><td> Arrayit Corporación </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> Fun1 [2-cloruroRO-4-(2,3-dihidro-3-metil-(benzo -1,3-tiazol-2-il)-metiliden)-1-fenil quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp. </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazol </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc. </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> La anfotericina B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 50 a 020-PC </td></tr><tr><td> Consejo de cerámica 190 m del orificio </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Software Prism </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> GenePix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

Candida albicans sigue siendo el principal agente etiológico de la candidiasis, que actualmente representa la infección nosocomial cuarto torrente sanguíneo más común en los hospitales de Estados Unidos 1. Estas infecciones oportunistas constituyen una amenaza creciente de un número creciente de individuos comprometidos, y llevar a las tasas de mortalidad inaceptablemente alta. Esto es en parte debido al arsenal limitado de fármacos antifúngicos, sino también a la aparición de resistencia contra los agentes más comúnmente utilizados antifúngicos. Para complicar más el tratamiento es el hecho de que una mayoría de las manifestaciones de la candidiasis están asociados con la formación de biopelículas, y dentro de estas células biopelículas muestran mayores niveles de resistencia a la mayoría clínicamente utilizados agentes antifúngicos 2. Aquí se describe el desarrollo de una micromatriz de alta densidad que consiste de C. albicans nano-biopelículas, que hemos denominado Ca BChip 3. En pocas palabras, un microarrayer robótica se utiliza to las células de levadura de impresión de C. albicans sobre un sustrato sólido. Durante la impresión, las células de levadura están encerrados en una matriz tridimensional utilizando un volumen tan bajo como 50 nL y inmovilizado sobre un sustrato de vidrio con un recubrimiento adecuado. Después de la impresión inicial, los portaobjetos se incubaron a 37 ° C durante 24 horas para permitir el desarrollo del biofilm. Durante este período, los puntos se convierten en la plena madurez &quot;nano-biofilms&quot; que muestran las características típicas estructurales y fenotípicos asociados con la madurez C. albicans biopelículas (es decir, la complejidad morfológica, tres dimensiones y la arquitectura de resistencia a los medicamentos) 4. En general, el BChip Ca está compuesto de ~ 750 biopelículas equivalentes y distinta espacialmente, con la ventaja adicional de que múltiples chips se pueden imprimir y procesan simultáneamente. La viabilidad celular se calcula midiendo la intensidad de fluorescencia de Fun1 metabólica mancha utilizando un escáner de microarrays. Este chip de hongos es ideal para la Use en verdad cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos antifúngicos. En comparación con los estándares actuales (es decir, el modelo de microtitulación de 96 pocillos de la formación de biopelículas 5), las principales ventajas del chip biopelícula hongos son automatización, miniaturización, el ahorro en la cantidad y el coste de los reactivos y el tiempo de análisis, así como la eliminación del trabajo pasos intensivos. Creemos que el chip de tal forma significativa a acelerar el proceso de descubrimiento de fármacos antifúngicos.

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Hemos desarrollado una plataforma de microarrays de alta densidad que consiste en 3D nano-biopelículas de<em&gt; C. albicans</em&gt; Llamada<em&gt; Ca</em&gt; BChip. El perfil de susceptibilidad de medicamentos probados en una<em&gt; Ca</em&gt; BChip es comparable a la del modelo convencional de la placa de 96 pozos, lo que sugiere que el chip de hongos es ideal para una verdadera selección de alto rendimiento de los fármacos antimicóticos.

Candida albicans biofilm Chip (Ca BChip) para la selección de alto rendimiento antifúngico

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K vistas.  University of Texas at San Antonio. Hemos desarrollado una plataforma de microarrays de alta densidad que consiste en 3D nano-biopelículas de C. albicans Llamada Ca BChip. El perfil de susceptibilidad de medicamentos probados en una Ca BChip es comparable a la del modelo convencional de la placa de 96 pozos, lo que sugiere que el chip de hongos es ideal para una verdadera selección de alto rendimiento de los fármacos antimicóticos.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Investigación

Bioingeniería

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Una rápida y cuantitativa método fluorimétrico para la proteína-Targeting Pequeña Molécula De Drogas

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

Aplicaciones para paneles de iluminación compatibles con microplacas de código abierto

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...