Este protocolo muestra un método de amplificación de círculo rodante para detectar la actividad de la topoisomerasa 1 en muestras crudas de una manera rápida y sencilla. Las principales ventajas de este método son que es fácil de seguir también por investigadores no experimentados, y es más sensible en comparación con los otros ensayos basados en gel cuando se utilizan extractos crudos. La aplicación de este protocolo se extiende desde la medición de la respuesta al tratamiento farmacológico, hasta el cribado de compuestos de moléculas pequeñas con potencial efecto anticancerígeno o antiinfeccioso.
La demostración del procedimiento estará a cargo del especialista en desarrollo de Karol Mizielinski de nuestro laboratorio. Para comenzar, conecte una rejilla de aislamiento de silicona diseñada a medida a un portaobjetos funcionalizado, haciendo así el fabricante de pozos. Presione hacia abajo la rejilla de silicona para evitar la formación de burbujas de aire entre la superficie del vidrio y la silicona.
A continuación, prepare la mezcla de imprimación agregando cinco micromolares, cinco imprimaciones de aminoácidos primarios en un búfer de impresión de una sola vez. Luego agregue cuatro microlitros de esta mezcla a cada pocillo e incube el fabricante del pozo en una cámara de hibridación con cloruro de sodio saturado. Para generar sustratos circulares cerrados, agregue dos microlitros de cinco sustratos específicos de la topoisomerasa micromolar 1 y dos microlitros de la enzima topoisomerasa 1 recombinante o un extracto celular preparado a 16 microlitros de tampón de reacción de la topoisomerasa de una sola vez.
Incubar esta mezcla circular a 37 grados centígrados durante 30 minutos, y detener la reacción enzimática añadiendo dos microlitros de 1% sds. Sumerja la máquina de pozos en una bandeja llena con tampón 1, precalentada a 50 grados centígrados. Pipetea el amortiguador en los pozos para asegurarte de que no queden burbujas de aire dentro del fabricante del pozo, y luego incuba la bandeja durante 30 minutos a 50 grados centígrados.
Después de la incubación, retire el tampón 1 y lave dos veces con agua destilada agitando vigorosamente durante un minuto entre lavados. Retire el agua, a continuación, agregue el tampón 2, precalentado a 50 grados centígrados a la bandeja, luego incube y lave el fabricante del pozo como se demostró anteriormente para el tampón 1. A continuación, lave la máquina de pozos con etanol al 70%, agitando vigorosamente durante un minuto y use aire comprimido para permitir que la configuración se seque.
Para realizar la hibridación, agregue cuatro microlitros de la mezcla circular preparada a cada pocillo correspondiente y coloque el fabricante del pozo en una cámara de humedad con agua destilada a 37 grados centígrados durante una hora. Al final de la incubación, lave la máquina de pozos durante un minuto cada una y tampón 3, tampón 4 y etanol al 70%, luego déjelo secar al aire. Prepare y agregue cuatro microlitros de la mezcla RCA a cada pocillo de la máquina de pozos, e incube a 37 grados centígrados durante dos horas en la cámara de humedad.
Para visualizar microscópicamente los productos de círculo rodante fluorescente amplificados, primero, lave el portaobjetos con tampón 3, tampón 4 y etanol al 70%. Seque el portaobjetos con aire comprimido y péguelo en un portaobjetos de microscopio. Marque la posición de los pocillos con un marcador y luego retire la rejilla de silicona con pinzas.
Para permitir la visualización en la cámara, monte la diapositiva con dos microlitros de medio de montaje sin dapi y agregue un vidrio de cubierta. Analice el portaobjetos con un microscopio de fluorescencia, con una lente objetiva de inmersión en aceite de 60x y una cámara. Después de la creación de imágenes, importe las imágenes a la imagen J y apile las imágenes haciendo clic en Imagen, luego Pilas e Imágenes para apilar, luego cambie el tipo de imagen a 8 bits.
Para establecer el umbral, haga clic en Imagen, Ajustar y luego en Umbral. Establezca la barra inferior en 255 y ajuste la barra superior para que solo las señales correctas sean rojas y el fondo sea negro. Barra las imágenes individuales y asegúrate de que corresponden a las imágenes antes de ajustar el umbral.
Asegúrese de que el umbral se establezca lo más bajo posible antes de que las señales reales comiencen a desaparecer. Para contar las señales, haga clic en Analizar, seguido de Analizar partículas y asegúrese de que el campo resumido en la configuración de la imagen J esté marcado. Agregue cuatro microlitros de anticuerpo antibiotina conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido a cada pocillo e incube a 15 a 25 grados centígrados durante 50 minutos en la cámara de humedad.
Al final de la incubación, lave la máquina de pozos tres veces con tampón 5 durante tres minutos cada una y déjela secar. Para visualizar la quimioluminiscencia, agregue dos microlitros de luminol ECL recién preparada y mezcla de peróxido de hidrógeno a los pocillos y visualice la diapositiva usando una cámara CCD o en películas de rayos X. Alternativamente, para visualizar con TMB, retire la rejilla de silicona después del lavado del tampón 5 y agregue 400 microlitros de TMB encima de todo el portaobjetos.
Mantenga el portaobjetos en una cámara de humedad y espere de cinco a 10 minutos para que se desarrolle el color. Después de un revelado de color, lave la diapositiva con 70% de etanol y fotografíe la diapositiva con una cámara o teléfono móvil para analizarla con el software de imagen J. Importe la imagen a la imagen J y cambie el tipo de imagen a 8 bits haciendo clic en Tipo de imagen y luego en 8 bits.
Limite el área medida utilizando la herramienta de dibujo de rectángulos de la barra de herramientas para medir las bandas por separado y dibujar el área deseada. Mida la intensidad haciendo clic, Analizar y luego Medir. A continuación, mueva el área dibujada originalmente a la siguiente banda y mida.
Después de medir la intensidad de todas las bandas, trace los datos en el software deseado. La actividad de la topoisomerasa 1 determinada por una lectura de escáner fluorescente se representa aquí, como se evidencia a partir de la cuantificación. Esta lectura tiene un límite de detección de 12,5 nanogramos, aquí se muestran imágenes representativas y la cuantificación resultante obtenida mediante la lectura del microscopio fluorescente.
Este método de lectura tiene un límite de detección de 0,1 nanogramos, el umbral de detección de la quimioluminiscencia mejorada y los métodos de lectura de color o métrica fueron de 6 nanogramos. Usando las mismas lecturas, el límite de detección fue de 1.250 celdas para la ECL y 312 células para TMB. Cuando la actividad de la topoisomerasa 1 se midió a partir de extractos de células derivadas del adenocarcinoma colorrectal.
Como ejemplo de una aplicación de detección de fármacos, la actividad de la topoisomerasa 1 se midió en presencia de camptotecina o dimetilsulfóxido. Los resultados de la cuantificación mostraron que la camptotecina inhibe la topoisomerasa 1 una circularización mediada del sustrato como se esperaba. Este es un protocolo simple que solo requiere atención específica a los pasos de lavado y los tiempos de incubación de reacción.
También es posible investigar cómo los fármacos inhiben la actividad de la topoisomerasa 1, el uso de Reid es altamente sensible y fácil de realizar, permite la detección rápida de posibles inhibidores de la topoisomerasa 1 y el uso de la actividad de la topoisomerasa 1 como biomarcador para la respuesta a los medicamentos en cánceres.
