Este método puede detectar la actividad de las retrotransposiciones llamadas LINE-1s. Estos elementos genéticos móviles causan inserciones de novo en los genomas del cáncer y, por lo tanto, contribuyen a la inestabilidad genómica. La ventaja de esta técnica basada en PCR es que es simple y rentable en comparación con los enfoques de secuenciación de alto rendimiento.
Aquí demostramos su utilidad en la detección de inserciones de novo que se originan a partir de una LINE-1 dentro del gen TTC28 en el cromosoma humano 22. La actividad de LINE-1 puede servir como biomarcador para la neoplasia maligna o pre-maligna, especialmente en los tipos de tumores epiteliales, como el cáncer de colon o el cáncer de ovario seroso de alto grado. Además de las inserciones LINE-1, este método puede detectar otras aberraciones genómicas, como reordenamientos de ADN que siempre necesitan reordenamiento por una razón.
Para seleccionar una enzima de restricción adecuada, y para diseñar imprimaciones inversas, primero, descargue la secuencia TTC28 LINE-1 en formato FASTA de una base de datos LINE-1, como L1Base. El ID de L1Base para TTC28 Line-1 es 135. Incluye cinco kilobases de secuencia, flanqueando tanto cinco primos como tres primos, al final de la secuencia Line-1.
Exporte la secuencia a un procesador de textos. Aquí la secuencia de flanqueo Line-1 se anota en fuente marrón y secuencias Line-1 en fuente gris. Determinar la etiqueta única en una secuencia de kilobase aguas abajo de los tres primos de TTC28 Line-1 y en una de las herramientas de predicción de señal de poliadenilación, como Polyadq o Dragon PolyA Spotter.
Anote toda la señal de poliadenilación en esta ventana de una kilobase. La secuencia entre la propia señal de poliadenilación débil de TTC28 LINE-1 resaltada aquí en rosa y la señal de poliadenilación más fuerte aguas abajo es la etiqueta única de esta LINE-1 resaltada aquí en amarillo. Para diseñar imprimaciones PCR inversas, introduzca la secuencia de etiquetas única en una herramienta de diseño de imprimación basada en web, como el Primer-BLAST de NCBI que genera imprimaciones PCR específicas, mantenga el parámetro de longitud del producto al mínimo para mostrar que los pares de imprimación están cerca uno del otro.
Seleccione la base de datos del genoma adecuada. Como la salida de Primer Blast genera imprimaciones PCR convencionales una frente a la otra, utilice la función de complemento inverso para que el par de imprimación realice pcR inversa. Imprimaciones entre diseños, correspondientes a la señal de poliadenilación este siempre que sea posible.
Hemos desindigne tres pares de imprimación, resaltados en azul y verde, correspondientes a tres señales de poliadenilación fuertes en la etiqueta única de TTC28 LINE-1. A continuación, para seleccionar una enzima de restricción adecuada, digiere la secuencia LINE-1, junto con sus cinco flancos aguas arriba y aguas abajo de cinco kilobases en sílice utilizando herramientas basadas en web, como RestrictionMapper. Esto dará una lista completa de enzimas de restricción que digiere esta razón, generando diferentes fragmentos de restricción.
Seleccione las enzimas de restricción que hacen un corte de cinco primos aguas arriba de los cinco extremos principales de LINE-1 o hacia el extremo 2 principal de la LINE-1 si está dentro de la LINE-1 sí mismo. Y una tarjeta de tres primeras aguas abajo de la etiqueta única. El fragmento de restricción nativa con secuencia LINE-1 y su etiqueta única hecha por enzimas de restricción selectiva, no debe ser más de 12 kilobases, ya que podría no ser amplificado por PCR eficientemente.
Tenga en cuenta que las enzimas de restricción selectiva serían insensibles a la metilación del ADN, deberían ser inactivables por calor y deberían generar extremos pegajosos que sean complementarios entre sí. Con el fin de demostrar PCR inversa inversa de larga distancia, utilizaremos la enzima de restricción SacI que corta el ADN en los sitios DAZCTC resaltados aquí en verde claro. SacI cumple con todos los criterios en el locus TTC28 LINE-1 y genera un fragmento de restricción nativo de 5.700 pares base.
Extraiga ADN genómico de muestras utilizando un kit de extracción de ADN disponible comercialmente que sea capaz de extraer ADN de alta calidad y de alta calidad necesario para la PCR inversa de larga distancia. Aquí hemos extraído ADN genómico de la línea celular de cáncer de mama MCF7 y sangre humana normal utilizando la instrucción de fabricación. Mida la concentración de ADN utilizando un fluorómetro.
100cientos nanogramos DE ADN en un gel de agarosa de una persona junto con un marcador de peso molecular de ADN para comprobar la calidad y cantidad del ADN. Para hacer plantillas circulares de ADN, primero digiere el ADN con la enzima de restricción adecuada. Aquí utilizamos SacI para digerir MCF7 y ADN genómico de sangre Hacer una mezcla de reacción de digestión de acuerdo con el protocolo de texto.
Mezcle brevemente la solución moviendo el tubo y la centrífuga. Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante una hora seguida de inactivación por calor, según las instrucciones del fabricante. A continuación, haga una solución de mezcla maestra de reacción de ligadura de acuerdo con el protocolo de texto para auto-ligar el ADN digerido.
Para cada reacción, añada 30 microlitros de esta mezcla maestra de reacción de ligadura directamente a 50 microlitros de solución de ADN digerido del paso anterior. Mezcle la solución agitando brevemente el tubo y centrifugando el tubo. Incubar esta mezcla de reacción en un ciclor térmico a 22 grados Celsius durante 10 minutos, terminando con un paso de inactivación de calor a 60 grados Centígrados durante otros 10 minutos.
Esta plantilla de ADN circular se utilizará en el siguiente paso de PCR inverso. Establezca un gradiente de temperatura de recocido en un ciclor térmico para determinar la temperatura óptima de recocido de imprimación por PCR de gradiente. Prepare una mezcla maestra para el PCR combinando y mezclando todos los componentes de acuerdo con el protocolo de texto.
Configure una reacción para cada temperatura de recocido en el gradiente. Para cada reacción, asigne 19 microlitros de los tubos PCR de mezcla maestra y agregue un microlitro de plantilla de ADN circular, generado a partir del ADN genómico de la sangre. Ejecute el programa PCR degradado.
Ejecutar seis microlitros de producto PCR, calentarlo a diferente temperatura de recocido en un solo curso en gel de agarosa. Para detectar la actividad de retrotransposición de novo TTC28 LINE-1 en el genoma de la línea celular MCF7, realice PCR utilizando un par de imprimación inversa en plantillas circulares de ADN, generadas a partir de la línea celular MCF-7. Siga las mismas instrucciones que para el PCR de gradiente, pero esta vez reemplazando el gradiente de temperatura con una temperatura de recocido óptima, que es de 64 grados centígrados.
Analizar los productos de PCR inversa de larga distancia por gel de agarosa para los resultados. Esta imagen de gel de agarosa tomada después de una electroforesia muestra el ADN genómico extraído de MCF7 y las muestras de sangre tienen un alto peso molecular, por lo que es adecuado para PCR inversa de larga distancia. Esta imagen de gel de agarosa tomada después de electroforesos muestra que el par de imprimación inversa que diseñamos amplifica la plantilla circular correcta en todas las temperaturas de recocido en el gradiente como se observa por un intenso intervalo entre 5 kilobase y siete marcadores de ADN kilobase.
Sin embargo, varias bandas también se observan a temperaturas más bajas, lo que indica una mala especificidad de la imprimación y bajas temperaturas de recocido. Por lo tanto, para este par de imprimación, 64 grados Celsius es la temperatura de recocido óptima. Esta imagen de gel de agarosa muestra el producto PCR obtenido después de realizar PCR inversa inversa de larga distancia sobre el ADN extraído de la línea celular MCF7 y sangre normal.
Un producto PCF de 5.700 pares base, marcados con un asterisco, representa el PCR nativo correspondiente a la línea 1 en su locus nativo. Este producto PCR nativo es visible tanto en MCF7 como en el ADN sanguíneo normal. La retrotransposición de De novo LINE-1 y el genoma MCF7 se pueden detectar como producto PCR de diferentes tamaños, junto con el producto PCR nativo en el gel de agarosa.
La secuenciación del producto PCR inverso de larga distancia mediante tecnologías de secuenciación de lectura larga de un solo molecular puede permitir la identificación de la identificación de objetivos en una resolución nuclearmente ajustada. Aunque un enfoque engorroso, la clonación y la secuenciación sanger del producto PCR inverso de larga distancia también es posible. En este vídeo, se detectó la actividad de un LINE-1 en el cromosoma 22.
El mismo flujo de trabajo se puede adaptar para monitorear otros LINE-1 que están activos en diferentes tipos de tumores.
