El objetivo general de este protocolo es presentar un método optimizado para el aislamiento de hepatocitos en ratones después de una hepatectomía parcial sin necesidad de centrifugación por gradiente de densidad. Por lo general, vemos un gran porcentaje de hepatocitos cargados de lípidos durante la regeneración temprana. Los hepatocitos esteatósicos que generalmente se pierden en la centrifugación del gradiente de densidad debido a la baja densidad se conservan con este protocolo.
Para preparar el equipo de perfusión, conecte una cánula IUI de calibre 26 al extremo de salida del tubo mediante un conector de bloqueo Luer. Luego enjuague el tubo e inserte el extremo de entrada del tubo en el tubo tampón de perfusión precalentado en el baño de agua. Prepárelo con tampón de perfusión caliente a una velocidad de bombeo de tres mililitros por minuto.
Antes de proceder con la cirugía, asegúrese de que el ratón esté adecuadamente anestesiado. Luego limpie el abdomen con una solución exfoliante quirúrgica y etanol al 70%. Luego corte las suturas para volver a abrir la incisión de la línea media previamente hecha para la hepatectomía parcial y separe suavemente los bordes de la herida.
Si la hepatectomía tiene más de 24 a 48 horas, retire la sutura y corte la piel con tijeras o un bisturí. Use un retractor o clips simples para mantener el abdomen abierto. La cavidad abdominal debe estar expuesta tanto como sea posible para optimizar el acceso y la visualización.
Fije una sutura de polipropileno 5-0 al esternón. Tire de él cranealmente y fíjelo en esta posición. Mueva los intestinos hacia la derecha usando hisopos de algodón estériles para revelar la vena porta y la vena cava.
Use un paño húmedo para retener los intestinos. Coloque un objeto pesado de aproximadamente dos centímetros de altura, como un anillo de peso de metal, adyacente a las patas traseras del ratón. Luego coloque el tubo con la cánula IUI de calibre 26 conectada sobre el objeto y coloque la aguja cuidadosamente sobre la vena cava.
Ajuste la longitud del tubo según sea necesario. Transfiera la solución madre de colagenasa al tubo tampón de digestión precalentado. Prepare de 10 a 20 mililitros de tampón de digestión por animal.
Encienda la bomba después de ajustar la velocidad de la bomba a tres mililitros por minuto. Deseche los primeros dos o tres mililitros del tampón de perfusión precalentado una vez que el tampón llegue a la aguja. Para realizar la canulación de la vena cava inferior, utilice un hisopo de algodón estéril para tirar suavemente de la vena cava caudalmente por debajo de la punción para que la tensión proporcionada facilite la inserción de la cánula en la vena.
Inserte la cánula de IIU de calibre 26 en un ángulo poco profundo en la vena cava inferior debajo del riñón mientras el tampón pasa a través de la aguja. Asegúrese de que el bisel de la aguja apunte hacia arriba. Busque sangre en la cámara de destello del catéter cuando la aguja entre en la luz.
Avance la aguja dos o tres milímetros adicionales para asegurarse de que la punta del catéter entre en la vena. Deslice el catéter de plástico sobre la aguja y dentro de la vena cava otros cinco milímetros. Retire la aguja lentamente y con mucho cuidado.
Después de dos o tres segundos, busque manchas blancas que se forman en el hígado o hinchazón de la vena porta, lo que indica que el tampón de perfusión fluye a través del hígado y entra en los lóbulos hepáticos desde la vena central. Espere a que la vena porta se hinche visiblemente dentro de uno o dos segundos de la formación de manchas blancas en la superficie del hígado. Corte la vena porta con tijeras lo más distalmente posible del hilio hepático.
Aumente la tasa de flujo de cuatro a siete mililitros por minuto dependiendo del peso del animal, el tamaño del hígado y la extensión de la hepatectomía inicial. Pinza la vena porta con pinzas o una pinza vascular durante siete a 10 segundos. Asegúrese de que no esté pasando líquido.
Realice una segunda pinza después de aproximadamente 30 segundos y asegúrese de que el hígado se hinche y se relaje. Continúe enjuagando al animal durante tres o cuatro minutos y observe el tampón claro que fluye fuera de la vena porta. Sujete la vena porta durante tres o cuatro segundos antes de que el tampón de digestión llegue al hígado.
Asegúrese de que el hígado se relaje al liberar la pinza y que el líquido de perfusión permanezca limpio. Una vez que el tampón de digestión llegue al hígado, sujete la vena porta una vez más. El hígado no debe relajarse después de la liberación del pinzamiento.
Digiera durante aproximadamente cuatro minutos a un caudal de cinco mililitros por minuto. A medida que avanza la digestión, busque signos de que el hígado comienza a hincharse y pequeñas secciones transparentes en la superficie del hígado. Observe que el hígado adquiere la textura de un trozo de tela mojado y parece casi empapado.
Pruebe la consistencia tocándola cuidadosamente con un hisopo de algodón húmedo y estéril. Continuar con la perfusión hasta que se pueda observar una marcada diferencia en la textura superficial del hígado. Observe que el hígado asume un color muy claro y una apariencia burbujeante que indica la cápsula de Glisson que se separa del parénquima.
Detenga la digestión tan pronto como el hígado haya adquirido estas propiedades. Retire la aguja antes de que el aire entre en el hígado. Agarre el tejido conectivo central entre los lóbulos con fórceps y levántelo ligeramente hacia arriba usándolo como punto de anclaje.
Cortar todas las conexiones del hígado a otros órganos y extirpar la vesícula biliar. Retire el hígado suavemente de la cavidad abdominal. Tenga cuidado, ya que será endeble y frágil en esta etapa.
Coloque el hígado en el tampón de conservación del hielo frío. Transfiera el hígado a una placa de Petri de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de Williams'Medium E.Break la cápsula de Glisson helada con pinzas de punta fina en algunos lugares a lo largo de la superficie del hígado. Agarra una parte central con dos pares de pinzas.
Separa lentamente, permitiendo que la cápsula se desgarre sin dañar los hepatocitos y libera las células agitando suavemente la cápsula. Filtre cinco mililitros de pulpa hepática a través de un filtro celular de 100 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Enjuague el filtro con 10 mililitros de medio fresco helado y filtre los cinco mililitros restantes de pulpa a través del colador celular.
Girar el extracto a 50 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando un mililitro para resuspender las células girando suavemente el tubo. Agregue 40 mililitros de Williams'E Medium frío y repita el paso tres veces.
Proceder con el aislamiento de los hepatocitos como se describe en el texto manuscrito. Después de una hepatectomía al 70% en ratones, el rendimiento final de hepatocitos fue de aproximadamente 10 a 15 x 10 hasta el 6º con una viabilidad final media del 78%. Mientras que después de una hepatectomía extendida del 86%, el rendimiento de hepatocitos fue de cuatro a nueve x 10 hasta el 6º con una viabilidad media del 65%.
Después de las hepatectomías parciales, los hepatocitos muestran un aumento del tamaño celular en comparación con los hígados normales que corresponde a un mayor contenido de lípidos. Se observó un aumento del contenido de lípidos en hepatocitos murinos 24 horas después de la hepatectomía parcial, visto como un aumento en la granularidad u observado directamente por la presencia de vesículas lipídicas dentro de los hepatocitos agrandados. Mientras se usaba el método clásico de purificación de gradiente de densidad, los hepatocitos grasos grandes se perdieron en el sobrenadante y solo se recolectaron hepatocitos magros más pequeños en el pellet celular.
Con el protocolo mejorado, los hepatocitos llenos de lípidos no se perdieron y todos los hepatocitos se granularon. La sujeción repetitiva facilita el proceso de lavado. Con eso, el hígado se limpia de manera óptima de los componentes sanguíneos restantes que podrían inhibir las enzimas de digestión.
