Este protocolo alinea las mediciones de la velocidad de sedimentación globular con el último modelo físico y proporciona un análisis más sólido de la prueba. Este protocolo permite un uso más preciso y sistemático de la velocidad de sedimentación globular, pero también proporciona los valores convencionales. Anteriormente demostramos que esta técnica es particularmente relevante para los trastornos que presentan un valor bajo de velocidad de sedimentación globular.
Se puede utilizar para exámenes de diagnóstico para síndromes de neuroacantocitosis. Para comenzar, recoja la sangre en tubos estándar de EDTA de 9 mililitros y el suero en tubos de suero estándar de 9 mililitros. Para una compactación óptima de los eritrocitos empaquetados, centrifugar las muestras de sangre a 3, 000 g durante al menos siete minutos y aspirar el sobrenadante.
Ahora prepare mezclas de plasma autólogo y suero con proporciones determinadas. Por ejemplo, al preparar 2.5 mililitros de la mezcla de suero plasmático al 25% al 75%, agregue 0.625 mililitros de plasma a 1.875 mililitros de suero. Vuelva a suspender el pellet en PBS o en el líquido de suspensión deseado, y mezcle suavemente después de incluir el sobrenadante para el lavado.
Repita tres veces y realice el último lavado con el líquido de suspensión deseado. Extraiga el volumen requerido de células empaquetadas. Procese las células empaquetadas como un líquido altamente viscoso para una muestra de 4 mililitros a un hematocrito de 45%Suspenda 1.8 mililitros de células empaquetadas dentro de 2.2 mililitros de la mezcla de suero plasmático o cualquier otro líquido deseado.
Para extraer la cantidad requerida de muestra para la determinación del hematocrito, construya los capilares de microhematocrito sumergiendo su punta inferior en el líquido. Cuando la cantidad requerida de muestra se eleve en el tubo con succión capilar, cubra la abertura para detener el flujo. A continuación, selle los capilares con cera de sellado, colóquelos en la centrífuga de microhematocrito y páselos a 15, 000 g durante cinco minutos, según las instrucciones del fabricante.
Lea el nivel de hematocrito en el capilar y escríbalo como referencia. Ahora, para registrar la sedimentación de la muestra, coloque una cámara estable frente al soporte donde se dejarán los tubos de ESR en reposo, y use un fondo blanco iluminado para un mejor contraste. Usando tubos Westergren vacíos sin marcas, ajuste el enfoque y el campo de visión de la cámara para obtener la resolución más alta donde se colocarán las muestras.
Asegúrese de que los bordes de las imágenes estén alineados en direcciones vertical y horizontal. Luego tome una foto de un tubo escalado para extraer la resolución de píxeles. Configure la luz y el tiempo de exposición de la cámara para que tengan un fondo blanco pero sin saturación.
Llene el recipiente inferior del tubo Westergren con el volumen de las muestras correspondiente a las instrucciones del fabricante e insértelas en el recipiente inferior, según lo indique el fabricante. Una vez que el primer tubo esté listo, colóquelo en el soporte e inicie la grabación de la cámara. La grabación de una imagen cada minuto suele dar una buena resolución de la curva cinética de ESR.
Prepare y coloque las siguientes muestras. Asegúrese de no pararse ante ninguna muestra cuando se tome una fotografía. Después de la grabación, para extraer la curva de VSG utilizando el código de MATLAB, seleccione una región de interés donde solo sea visible un tubo, la parte ubicada en la posición más baja de la interfaz de plasma libre de células eritrocitarias pero dentro de la muestra.
Anote los valores de X, Y, W y H, y utilice estos valores en el script de MATLAB. Convierta la región de interés de la imagen RGB en una imagen o matriz en escala de grises. Por lo general, combinar los tres canales de color es muy eficiente con un fondo claro.
Luego binarize la imagen. Para una muestra sana, el uso del umbral ARC2 generalmente da un resultado consistente. Para muestras con un hematocrito alto o con algo de hemólisis, podría ser mejor ajustarlo manualmente o usar otro método automático, dependiendo del contraste exacto obtenido entre las diversas fases dentro del tubo.
Obtenga el promedio de los valores de píxeles de GR a lo largo de la dirección horizontal. Este paso minimiza el ruido y promedia eficientemente las posibles irregularidades de la interfaz. Antes de calcular las variaciones, suaviza la curva con una media móvil, especialmente si los tubos contienen algunas marcas horizontales.
Luego identifique la posición de la interfaz como el punto con la mayor variación de intensidad y repita para cada imagen y cada muestra. Para cada muestra, utilice cualquier software adecuado para guardar las posiciones de la interfaz a lo largo del tiempo en un formato apropiado para adaptarse al modelo físico. Utilizando cualquier software que se ajuste adecuadamente, conociendo el hematocrito y la altura inicial de la columna sanguínea, encuentre los valores del tiempo de retardo, el tiempo adimensional y la fracción de volumen empaquetado final de los eritrocitos, que minimizan la suma de las desviaciones residuales al cuadrado para el modelo físico.
Una vez extraída la curva cuantitativa de la imagen, guarde los parámetros físicos de la muestra. Los valores tradicionales de ESR a los 30 minutos, una hora o dos horas todavía se pueden extraer de la curva como referencia. La velocidad de sedimentación disminuye con el aumento del hematocrito o fracciones de volumen inicial.
La sedimentación de los eritrocitos se vuelve más lenta cuando disminuye la concentración de fibrinógeno. Se muestra la variación de la velocidad máxima de sedimentación extraída en función del hematocrito de la muestra y los valores obtenidos para el tiempo adimensional, la fracción de volumen empaquetado final del eritrocito y el tiempo de retardo. Se pudo ver que la corrección elimina la dependencia general del hematocrito inicial, así como la mayor parte de la dispersión de datos.
Se muestran los valores característicos de los parámetros extraídos para varias concentraciones de fibrinógeno. La velocidad de sedimentación inicial al comienzo del proceso de sedimentación aumenta con un aumento en la concentración de fibrinógeno. El tiempo característico adimensional de sedimentación disminuye con el aumento de la concentración de fibrinógeno.
La fracción de volumen final de los eritrocitos sedimentados es casi independiente de la concentración de fibrinógeno. El tiempo de retraso disminuye con el aumento de la concentración de fibrinógeno, lo que indica que las interacciones atractivas más fuertes aceleran el reordenamiento de las estructuras eritrocitarias iniciales que conducen al establecimiento de canales de fluidos. Uno de los puntos críticos con respecto a la adquisición de imágenes es tener un fondo brillante uniforme, ¿verdad?
Evite sombras pronunciadas alrededor de los tubos. La técnica podría utilizarse para la caracterización de otras enfermedades asociadas con una menor velocidad de sedimentación globular, como la anemia falciforme o el mal crónico de montaña.
