Este protocolo describe algunos métodos para cuantificar la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos. Se puede utilizar como una plataforma de cribado de alto rendimiento para probar fármacos que modulan la formación de gotas de lípidos. El método que describimos se basa en un tinte específico para gotas de lípidos y organoides intestinales derivados de biopsias.
Por lo tanto, proporciona un modelo estable, preciso y fisiológicamente relevante para la formación de gotas de lípidos. Este protocolo se puede utilizar para detectar nuevos candidatos a fármacos específicos del paciente que modulan la formación de gotas de lípidos, por ejemplo, en pacientes con deficiencia de DGAT1. Este ensayo de formación de gotas lipídicas también se puede aplicar a otros tipos de cultivos organoides para estudiar el metabolismo de los lípidos en otros tipos de células.
El ensayo depende en gran medida de la densidad del cultivo organoide. Trate de asegurar una densidad organoidea consistente entre muestras y experimentos. La demostración visual de este ensayo es crítica porque es importante mostrar cómo se debe cultivar el organoide y cómo deben tratarse para asegurar un análisis adecuado de la formación de gotas lipídicas.
Después de preparar los organoides, aspirar cuidadosamente el medio de cultivo sin alterar las gotas de la matriz de membrana del sótano. Añadir 500 microlitros de medio basal frío al primer pozo de organoides. Con una pipeta P1000, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para interrumpir las gotas de matriz de membrana del sótano con organoides.
Repita estos procedimientos con el mismo medio en el siguiente, así como sea necesario, pero no cosechar más de dos pozos por cada 500 microlitros de medio basal. Recoger los organoides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión, y girarlos hacia abajo en una centrífuga de mini-mesa durante 15 a 20 segundos. Añadir 400 microlitros de trippsina a los organoides hilados.
Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, utilice una pipeta P200 para pipetear suavemente la suspensión hacia arriba y hacia abajo para interrumpir los agregados restantes de las células. Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Cuando sólo quedan células individuales, agregue un mililitro de medio basal y gire hacia abajo las células en una centrífuga de mini-tabletop durante 15 a 20 segundos. Aspirar el sobrenadante por completo. Utilice una pipeta P200 para volver a suspender las células individuales en 200 microlitros de hSI-EM fresco, y agregue 800 microlitros adicionales de hSI-EM.
Luego cuente el número de celdas en suspensión y calcule el volumen de células necesarias para la densidad final de la celda. Saque el volumen adecuado de suspensión y ajuste la densidad a 750 células por microlitro. Agregue la matriz de membrana del sótano a la suspensión celular en una proporción de dos a uno.
Pipetee suavemente la suspensión para mezclar teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas. En una placa de cultivo precalentada, sembra tres gotas de 10 microlitros por pozo si la placa tiene 24 pozos o una gota de cinco microlitros por pozo si la placa tiene 96 pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados Celsius con un cinco por ciento de dióxido de carbono durante 10 a 15 minutos para solidificar las gotas.
Mientras tanto, precale el calentamiento de un volumen adecuado de hSI-EM+Y en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de esto, agregue cuidadosamente el hSI-EM+Y precalegado a cada pozo de la placa. Incubar las células a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono.
Después de dos o tres días, reemplace el medio por hSI-EM y asegúrese de actualizarlo de dos a tres veces por semana. Primero, pesa 0,2 gramos de ácido oleico líquido a temperatura ambiente. Añadir 1,5 mililitros de PBS estéril de grado de cultivo y calentar la mezcla a 70 grados Celsius durante una hora asegurándose de vórtice intermitentemente.
A continuación, pesar 5,89 gramos de BSA libre de ácidos grasos y disolverlo en 33,9 mililitros de PBS. Caliente la mezcla en un baño de agua a 37 grados Centígrados hasta que la BSA esté completamente disuelta. Vórtice la mezcla de ácido oleico de nuevo para crear una emulsión de gotas finas y añadir inmediatamente a la solución BSA utilizando una pipeta de vidrio.
Mantener la mezcla a 37 grados Centígrados durante 30 minutos hasta que quede una solución clara y amarillento. Pasar los organoides como se describió anteriormente y sembrar las células individuales derivadas de organoides en una placa negra de 96 pozos de fondo claro. En el sexto día de cultivo en hSI-EM, reemplace el medio de cultivo con hSI-EM que contiene un milimolar del ácido oleico y conjugado BSA.
Incubar las células durante 16 a 17 horas a 37 grados celsius en presencia o ausencia de 0,1 micromolar inhibidor de DGAT1. Después de esto, aspirar el medio sin perturbar las gotas de matriz de membrana del sótano. Fije los organoides añadiendo 100 microlitros de formaldehído tamponado cuatro por ciento neutro a los pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Retire el formaldehído suavemente y lave cuidadosamente las células con 150 microlitros de PBS por pozo. Mancha las células para gotas de lípidos con 025 miligramos por mililitro LD540 y DAPI en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, lave los pozos cuidadosamente con PBS.
Para obtener imágenes de visión general de organoides enteros, utilice un subjetivo 40X adecuado para imágenes fluorescentes confocales. Ajuste el microscopio a imagen para DAPI y el tinte LD540 utilizando los ajustes de excitación y emisión que se muestran aquí. Establezca el tamaño del agujero en una unidad venti sizey para una resolución suficiente del eje z.
Para crear una imagen de la mitad de un organoide esférico, establezca una pila z en aproximadamente 85 micrómetros. Usando un sistema de procesamiento de imágenes adecuado, transforme la pila z de cada organoide a una proyección máxima haciendo clic en Imagen, Pilas, Proyecto Z. Establezca el umbral de la proyección máxima en un nivel en el que no haya señal LD540 visible en la muestra de control del vehículo BSA haciendo clic en Imagen, Ajustar, Umbral.
Utilice esta configuración para umbralar cada imagen. A continuación, mida el área total de fluorescencia para cada proyección máxima utilizando la función Analizar, Analizar partículas. Para un análisis adecuado de la formación de gotas lipídicas, los organoides no deben ser sembrados demasiado densamente antes de la estimulación con ácido oleico y posterior tinción.
Esto es especialmente importante para la lectura confocal y del lector de placas, ya que los organoides superpuestos podrían interferir con la fluorescencia. Después de la estimulación con un mililitro de ácido oleico durante la noche, la formación de gotas lipídicas se puede visualizar con un microscopio de campo brillante invertido. La acumulación de gotas lipídicas dispersa la luz transmitida, y por lo tanto los organoides parecen más oscuros, mientras que los organoides no estimulados tienen un aspecto translúcido.
Una vez que los organoides estimulados por ácido oleico se fijan y se tiñen, la formación de gotas lipídicas se puede visualizar mediante un microscopio confocal. Como los organoides son estructuras 3D, un microscopio epifluorescente regular no es adecuado debido a la señal de fondo fuera de foco, por lo que se utiliza una pila z confocal para caracterizar LDF en organoides. La cuantificación de las muestras de microscopía confocal también se puede realizar utilizando un lector de placas fluorescentes normalizado a la señal fluorescente Hoechst.
El ensayo del lector de placas indica una disminución significativa de la señal LD540 en las células organoides tratadas con inhibidor de DGAT1 en comparación con los organoides no tratados. La cuantificación de la formación de LD en células individuales se puede lograr utilizando un citometro de flujo. La estrategia de gating que se muestra aquí es para organoides intestinales humanos disociados.
Los histogramas representativos tanto para la señal SSC-A como para la señal LD540 de la población final de células vivas muestran que la formación de gotas lipídicas dará lugar a un aumento de la SSC-A debido a la formación de gotas lipídicas intracelulares. Además, LD540 manchas para los lípidos que se almacenan en las gotas de lípidos, y la señal también aumentará en la inducción de la formación de gotas de lípidos. Como tal, la formación de gotas lipídicas se mide como un cambio en la intensidad fluorescente media de SSC-A y LD540.
Los pasos más cruciales de este protocolo son el cultivo de organoides intestinales humanos y la corrugado adecuado de ácido oleico a BSA. Para adaptarse a más condiciones, este ensayo se puede analizar utilizando un lector de placas fluorescentes. Para corregir el número de organoide por pozo, la señal LD540 se normalizó a la señal DAPI.
Con esta técnica, los investigadores pueden estudiar la formación de gotas lipídicas en sistemas organoides, y mejorar diversas técnicas de análisis como la microscopía electrónica para validar sus hallazgos.
