يسمح فحص مضان الكالسيوم عالي الإنتاجية بتحديد روابط جزيئية صغيرة جديدة لمستقبل مقترن بالبروتين G الذي يشير عبر سلسلة الكالسيوم داخل الخلايا. الميزة الرئيسية لمقايسة الإضافة المزدوجة هي اكتشاف ناهض ومضاد HTS في مقايسة واحدة بنفس الخلايا بشرط أن تستمر إشارة التألق لمدة دقيقتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي GPCR يشير من خلال سلسلة الكالسيوم ، والتي تشمل معظم عائلة الببتيد العصبية المفصلية ، وهي GPCRs.
من أجل استنساخ الفحص ، من المهم تحسين كثافة الخلية وسرعة الحقن وتركيز الناهض المعروف للإصدار الثاني. ستوضح الإجراء بيانكا هنريك سانتوس ، باحثة ما بعد الدكتوراه المشاركة في مختبري. ابدأ مقايسة مضان الكالسيوم عن طريق إزالة الوسط المستهلك من دورق T-75 الذي يحتوي على 70 إلى 90٪ من خلايا BMLK الثلاث.
اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من محلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات أو DPBS. بعد إزالة DPBS ، افصل الخلايا باستخدام ملليلتر من 0.25٪ تربسين إيثيلين ديامينيترايتيك حمض أو EDTA واحتضانها لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف ثمانية ملليلتر من الوسط الانتقائي وانقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.
قبل الطرد المركزي تعليق الخلية في 1000 × غرام لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 ملليلتر من وسط F-12K الذي يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني أو FBS و 400 ميكروغرام لكل ملليلتر كبريتات G418. لتحديد كثافة الخلية للتعليق لمزيد من التخفيف ، امزج 20 ميكرولترا من معلق الخلية في 20 ميكرولترا من 0.4٪ من التريبان الأزرق ، ثم قم بتحميل خليط 20 ميكرولتر في غرفة عد الخلايا ليتم قراءتها بواسطة عداد الخلايا لكثافة الخلية.
قم بتخفيف معلق الخلية باستخدام نفس وسيط F-12K وقم بتكوين الحجم النهائي إلى 15 ملليلتر بكثافة أربعة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر. لزرع الخلايا في Poly-D ليسين أو PDL مشفرة 384 لوحة بئر. أضف 25 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف إلى 384 بئرا من اللوحة باستخدام نظام معالجة السوائل.
احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الحاضنة المرطبة. في اليوم التالي ، اقلب بسرعة لوحة البئر 384 المتقاربة بنسبة 90٪. لإزالة الوسط المستهلك ومسحه برفق على مناشف ورقية معقمة مرتين إلى ثلاث مرات لإزالة كل السائل من اللوحة.
نفذ الخطوات التالية في الضوء الخافت الناعم داخل خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من صبغة التحميل في كل بئر باستخدام نظام مناولة السوائل عن طريق توزيع 12.5 ميكرولتر في كل بئر بسرعة شفط وتوزيع تبلغ 3.8 ميكرولتر في الثانية. كرر خطوة السحب هذه للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر في كل بئر.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء المحيط واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد موازنة اللوحة المغطاة لمدة 30 دقيقة أخرى ، تكون الخلايا جاهزة للفحص عالي الإنتاجية أو HTS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة الدواء عند 1200 × جم في جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة.
انقل محلول الببتيد الناهض 10x من Rhimi-K-1 إلى خزان صديق للسيارات سعة 150 ملليلتر. في قارئ اللوحة، انقر على إدارة البروتوكولات. ثم في بروتوكول كثافة الفلورسنت لنقطة النهاية ، حدد Flow Forte للقراءة المسبقة ، وانقر فوق بدء القياس لقياس إشارة الخلفية لفحص HTS بالكامل.
أدخل لوحة الخلية في قارئ اللوحة. في لوحة العدادات، انقر على بئر عشوائي على اللوحة ثم انقر فوق ارتفاع التركيز البؤري الجديد. انقر فوق ضبط التركيز.
انقر فوق تعديل الكسب. قم بتعيينه من 5٪ إلى 10٪ من الحد الأقصى لقيمة التألق القابلة للقياس. انقر فوق بدء التعديل.
انقر فوق بدء القياس لقراءة اللوحة بأكملها لإشارة مضان الخلفية في وحدات التألق النسبية أو RFU. أثناء قراءة اللوحة ، انقر فوق الحالة الحالية لرؤية قيمة القراءة في الوقت الفعلي. بالنسبة لفحص الإضافة المزدوجة ، ماصة 10 ميكرولتر من محلول الدواء لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام نظام معالجة السوائل وشفط 1.5 ميكرولتر من كل بئر من صفيحة الدواء بسرعة شفط 1.0 ميكرولتر في الثانية.
قم بتوزيع 0.5 ميكرولتر من المركبات في مقايسة الخلية للوصول إلى تركيز نهائي قدره اثنين ميكرومولار في 0.2٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو DMSO. بعد إضافة مركبات الغربلة ، ضع لوحة الفحص على الفور في قارئ اللوحة. انقر فوق برنامج القراءة المعين مسبقا واقرأ اللوحة في اتجاهات القراءة الأمامية والخلفية.
تخلص من ميكرولتر واحد من محلول الدواء المتبقي في الأطراف عن طريق غمر الأطراف في خزان نفايات سعة 150 ملليلتر يحتوي على حوالي 50 ملليلتر من DPBS. احتضان مركبات الغربلة مع الخلايا لمدة خمس دقائق ، بما في ذلك الوقت داخل قارئ اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية مع إطفاء الأنوار. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولتر من ناهض الببتيد Rhimi-K-1 من الخزان إلى لوحة الفحص باستخدام نظام معالجة السوائل باستخدام 384 12.5 طرف ميكرولتر.
ضع اللوحة في قارئ اللوحة على الفور. انقر فوق برنامج القراءة المعين مسبقا واقرأ اللوحة في اتجاهات القراءة الأمامية والخلفية. بمجرد الانتهاء يدويا ، قم بحساب Z'factor لمراقبة الجودة لكل فحص لوحة.
حدد يدويا جزيئات الضرب من الخرائط الحرارية على منصة بيانات HTS عبر الإنترنت واحسب النسبة المئوية للتنشيط الطبيعي أو NPA والنشاط المثبط ، أو I0 لضربات الناهض وضربات الخصم. تم استخدام لوحة دواء داخلية SAC2-34-6170 تتكون من 320 جزيئا صغيرا عشوائيا لإظهار اختبار HTS هذا. كان لدى HTS جودة فحص ممتازة مع عامل Z'0.7 يعكس جودة الفحص المستقلة عن المركبات المختبرة.
من الضروري قراءة اللوحة مباشرة بعد إضافة الناهض لأن إشارة التألق قصيرة العمر. بعد هذا الإجراء ، يجب التحقق من صحة جزيء الضربة المحدد من خلال فحوصات استجابة الجرعة واختبارها في الخلايا التي لا تعبر عن GPCR المستهدف لاستبعاد الضربات خارج الهدف.
