בדיקת התוסף הפלואורסצנטי הכפול של סידן בתפוקה גבוהה מאפשרת זיהוי של ליגנדות חדשניות של מולקולות קטנות של קולטן מצומד לחלבון G המאותת דרך מפל הסידן התוך-תאי. היתרון העיקרי של בדיקת התוספת הכפולה הוא זיהוי של אגוניסט ואנטגוניסט HTS בבדיקה אחת עם אותם תאים בתנאי שהאות הפלואורסצנטי נמשך שתי דקות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל GPCR המאותת דרך מפל הסידן, הכולל את רוב משפחת פפטידי הנוירונים פרוקי הרגליים, GPCRs.
לצורך שכפול הבדיקה, חשוב לייעל את צפיפות התא, מהירות ההזרקה והריכוז של האגוניסט הידוע למהדורה השנייה. מי שתדגים את ההליך תהיה ביאנקה הנריקס-סנטוס, עמיתת מחקר בתר-דוקטוריאלית במעבדה שלי. התחל את בדיקת הסידן הפלואורסצנטי על ידי הסרת המדיום המושקע מבקבוקון T-75 המכיל 70 עד 90% BMLK שלושה תאים.
שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של תמיסת מלח או DPBS של דולבקו. לאחר הסרת DPBS, לנתק את התאים באמצעות שני מיליליטר של 0.25% טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה או EDTA ודגרה במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום סלקטיבי ומעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
לפני צנטריפוגה ההשעיה התא ב 1000 x גרם במשך שלוש דקות. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשהות את גלולת התא ב-10 מיליליטר של מדיום F-12K המכיל 1% סרום בקר עוברי או FBS ו-400 מיקרוגרם למיליליטר G418 סולפט. כדי לקבוע את צפיפות התאים של התרחיף לצורך דילול נוסף, ערבבו 20 מיקרוליטרים של תרחיף תאים ל-20 מיקרוליטרים של 0.4% טריפן כחול, ולאחר מכן טענו תערובת של 20 מיקרוליטרים לתוך תא ספירת תאים כדי להיקרא על ידי מונה תאים לצפיפות התא.
לדלל את תרחיף התא באמצעות אותו מדיום F-12K ולהרכיב את הנפח הסופי ל 15 מיליליטר בצפיפות של ארבע פעמים 10 עד החמישי תאים למיליליטר. כדי לזרוע את התאים בליזין Poly-D או PDL מקודד 384 צלחת היטב. הוסף 25 מיקרוליטר של תרחיף התא המדולל לתוך 384 בארות של הצלחת באמצעות מערכת טיפול בנוזל.
יש לדגום את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור הלח. ביום שלמחרת, הפוך במהירות את צלחת הקידוח 384 בעלת 90%. כדי להסיר את המדיום בילה בעדינות מוכתם על מגבות נייר סטריליות פעמיים עד שלוש כדי להסיר את כל הנוזלים מהצלחת.
בצע את השלבים הבאים באור העמום הרך בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של צבע ההעמסה לכל באר באמצעות מערכת טיפול בנוזלים על ידי חלוקת 12.5 מיקרוליטרים לכל באר עם שאיפה ומהירות חלוקה של 3.8 מיקרוליטר לשנייה. חזור על שלב פיפטינג זה כדי להגיע לנפח סופי של 25 מיקרוליטר בכל באר.
לאחר שתסיימו, כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור הסביבה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הלח של פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר שיווי משקל הצלחת המכוסה למשך 30 דקות נוספות, התאים מוכנים לבדיקת תפוקה גבוהה או HTS. לאחר מכן, צנטריפוגה צלחת התרופה ב 1200 x גרם צנטריפוגה צלחת במשך דקה אחת.
העבר את תמיסת הפפטיד האגוניסט 10x של Rhimi-K-1 למאגר ידידותי לרכב של 150 מיליליטר. בקורא הלוחות, לחץ על נהל פרוטוקולים. לאחר מכן, בפרוטוקול עוצמת הפלואורסצנט של נקודת הקצה, בחר Flow Forte לקריאה מראש, לחץ על התחל מדידה כדי למדוד את אות הרקע עבור כל בדיקת HTS.
הכנס את לוחית התא לקורא הלוחות. בלוח המחוונים, לחץ על באר אקראית על הצלחת ולאחר מכן לחץ על גובה מיקוד חדש. לחץ על התאמת המיקוד.
לחץ על התאמת רווח. הקצה אותו כ- 5% עד 10% מערך הפלואורסצנציה המרבי הניתן למדידה. לחץ על התחל התאמה.
לחץ על התחל מדידה כדי לקרוא את כל הלוח עבור אות הפלואורסצנציה ברקע ביחידות פלואורסצנטיות יחסית או RFU. בזמן קריאת הלוחית, לחץ על מצב נוכחי כדי לראות את ערך הקריאה בזמן אמת. עבור הבדיקה הכפולה הנוספת, פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת התרופה למעלה ולמטה שלוש פעמים באמצעות מערכת הטיפול בנוזל ושאיפה 1.5 מיקרוליטר מכל באר של צלחת התרופה במהירות שאיפה של 1.0 מיקרוליטר לשנייה.
יש לפזר 0.5 מיקרוליטרים של התרכובות לתוך בדיקת התא כדי להגיע לריכוז סופי של שני מיקרומולרים ב-0.2% דימתיל סולפוקסיד או DMSO. לאחר הוספת תרכובות ההקרנה, הנח את צלחת הבדיקה מיד לתוך קורא הלוחות. לחץ על תוכנית הקריאה המוגדרת מראש וקרא את הלוח בכיווני הקריאה קדימה ואחורה.
השליכו מיקרוליטר אחד של תמיסת תרופות שנותרה בקצוות על ידי טבילת הטיפים לתוך מאגר פסולת של 150 מיליליטר המכיל כ-50 מיליליטר של DPBS. דגרו את תרכובות הסינון עם התאים למשך חמש דקות בסך הכל, כולל הזמן בתוך קורא הצלחות בארון הבטיחות הביולוגית כשהאורות כבויים. לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של הפפטיד האגוניסט Rhimi-K-1 מהמאגר לתוך צלחת הבדיקה באמצעות מערכת הטיפול בנוזל באמצעות 384 12.5 מיקרוליטר טיפים.
הכניסו את הצלחת מיד לקורא הצלחות. לחץ על תוכנית הקריאה המוגדרת מראש וקרא את הלוח בכיווני הקריאה קדימה ואחורה. לאחר ביצוע פעולה ידנית לחשב את Z'factor עבור בקרת האיכות של כל בדיקת צלחת.
בחר באופן ידני את מולקולות הלהיט ממפות החום בפלטפורמת הנתונים המקוונת של HTS וחשב את הפעלת האחוזים המנורמלת או NPA ופעילות מעכבת, או I0 עבור הלהיטים האגוניסטיים והפגיעות האנטגוניסטיות. לוחית תרופות פנימית SAC2-34-6170 המורכבת מ-320 מולקולות קטנות אקראיות שימשה להדגמת בדיקת HTS זו. ל-HTS הייתה איכות בדיקה מצוינת עם גורם Z'factor של 0.7 המשקף שאיכות הבדיקה אינה תלויה בתרכובות שנבדקו.
זה חיוני כדי לקרוא את הצלחת מיד לאחר הוספת אגוניסט כי האות פלואורסצנטי הוא קצר מועד. לאחר הליך זה, יש לאמת את מולקולת הפגיעה שזוהתה באמצעות מבחני תגובת מינון ולבדוק בתאים שאינם מבטאים את GPCR המטרה כדי לא לכלול פגיעות מחוץ למטרה.
