Yüksek Verimli tarama kalsiyum floresan çift ilaveli test, hücre içi kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren bir G proteinine bağlı reseptörün yeni küçük molekül ligandlarının tanımlanmasına izin verir. İkili toplama testinin temel avantajı, floresan sinyalinin iki dakika sürmesi koşuluyla aynı hücrelerle tek bir tahlilde agonist ve antagonist HTS'nin saptanmasıdır. Bu yöntem, eklembacaklı nöron peptid ailesinin, bir GPCR'nin çoğunu içeren kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren herhangi bir GPCR'ye uygulanabilir.
Tahlil tekrarlanabilirliği için, ikinci baskı için bilinen agonistin hücre yoğunluğunu, enjeksiyon hızını ve konsantrasyonunu optimize etmek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırma görevlisi olan Bianca Henriques-Santos olacak. Kalsiyum floresan tahliline, harcanan ortamı% 70 ila% 90 oranında akıcı BMLK üç hücre içeren T-75 şişesinden çıkararak başlayın.
Hücreleri 10 mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya DPBS ile yıkayın. DPBS'yi çıkardıktan sonra, iki mililitre% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit veya EDTA kullanarak hücreleri ayırın ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın. Sekiz mililitre seçici ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Hücre süspansiyonunu üç dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj etmeden önce. Süpernatantı atın ve hücre peletini% 1 fetal sığır serumu veya FBS ve mililitre G418 sülfat başına 400 mikrogram içeren 10 mililitre F-12K ortamında yeniden askıya alın. Daha fazla seyreltme için süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirlemek için, 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu 20 mikrolitre% 0.4 tripan mavisine karıştırın ve ardından 20 mikrolitre karışımı, hücre yoğunluğu için bir hücre sayacı tarafından okunmak üzere bir hücre sayma odasına yükleyin.
Aynı F-12K ortamını kullanarak hücre süspansiyonunu seyreltin ve mililitre başına dört kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda 15 mililitreye kadar son hacmi oluşturun. Poly-D lizin veya PDL kodlu 384 kuyu plakasındaki hücreleri tohumlamak. Bir sıvı taşıma sistemi kullanarak plakanın 384 kuyucuğuna 25 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
Plakayı nemlendirilmiş inkübatörde gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün,% 90 akıcı 384 kuyu plakasını hızla tersine çevirin. Harcanan ortamı çıkarmak ve steril kağıt havlular üzerine hafifçe lekelenmek için tüm sıvıyı plakadan çıkarmak için iki ila üç kez.
Sonraki adımları biyogüvenlik kabininin içindeki yumuşak loş ışıkta gerçekleştirin. Daha sonra, saniyede 3,8 mikrolitre aspirasyon ve dağıtım hızı ile her bir kuyucuğa 12,5 mikrolitre dağıtarak bir sıvı taşıma sistemi kullanarak her bir kuyucuğa 25 mikrolitre yükleme boyası ekleyin. Her bir kuyucukta 25 mikrolitrelik son hacme ulaşmak için bu pipetleme adımını tekrarlayın.
Bir kez bittiğinde, ortam ışığından korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kapalı plakayı 30 dakika daha dengeledikten sonra, hücreler yüksek verimli tarama veya HTS için hazırdır. Daha sonra, ilaç plakasını bir dakika boyunca bir plaka santrifüjünde 1200 x g'de santrifüj edin.
Rhimi-K-1'in 10x agonist peptid çözeltisini 150 mililitrelik otomatik dostu bir rezervuara aktarın. Plaka okuyucuda, protokolleri yönet'i tıklayın. Ardından uç nokta floresan yoğunluğu protokolünde, Flow Forte önceden okuma'yı seçin, HTS testinin tamamı için arka plan sinyalini ölçmek üzere ölçümü başlat'a tıklayın.
Hücre plakasını plaka okuyucuya yerleştirin. Gösterge panelinde, plakadaki rastgele bir kuyuya ve ardından yeni odak yüksekliğine tıklayın. Odak ayarına tıklayın.
Kazanç ayarlamasına tıklayın. Maksimum ölçülebilir floresan değerinin% 5 ila% 10'u olarak atayın. Ayarlamayı başlat'ı tıklayın.
Göreceli floresan birimleri veya RFU'daki arka plan floresan sinyalinin tüm plakasını okumak için ölçümü başlat'ı tıklatın. Plaka okurken, gerçek zamanlı okuma değerini görmek için geçerli durumu tıklayın. Çift ilaveli tahlil için, sıvı taşıma sistemini kullanarak ilaç çözeltisinin 10 mikrolitresini üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ilaç plakasının her bir kuyucuğundan saniyede 1.0 mikrolitre aspirasyon hızında 1.5 mikrolitre aspire edin.
% 0.2 dimetil sülfoksit veya DMSO'da iki mikromolar'ın nihai konsantrasyonuna ulaşmak için bileşiklerin 0.5 mikrolitresini hücre tahliline dağıtın. Eleme bileşiklerini ekledikten sonra, tahlil plakasını hemen plaka okuyucusuna yerleştirin. Önceden ayarlanmış okuma programına tıklayın ve plakayı ileri ve geri okuma yönlerinde okuyun.
Uçlarda kalan bir mikrolitre ilaç çözeltisini, uçları yaklaşık 50 mililitre DPBS içeren 150 mililitrelik bir atık rezervuarına batırarak atın. Tarama bileşiklerini, ışıklar kapalıyken biyogüvenlik kabinindeki plaka okuyucunun içindeki süre de dahil olmak üzere toplam beş dakika boyunca hücrelerle birlikte inkübe edin. Daha sonra, 384 12.5 mikrolitre uç kullanarak sıvı taşıma sistemini kullanarak rezervuardan üç mikrolitre agonist peptid Rhimi-K-1'i tahlil plakasına ekleyin.
Plakayı hemen plaka okuyucuya yerleştirin. Önceden ayarlanmış okuma programına tıklayın ve plakayı ileri ve geri okuma yönlerinde okuyun. Bir kez yapıldıktan sonra, her plaka testinin kalite kontrolü için Z'faktörünü manuel olarak hesaplayın.
Çevrimiçi HTS veri platformundaki ısı haritalarından isabet moleküllerini manuel olarak seçin ve agonist isabetleri ve antagonist isabetleri için normalleştirilmiş yüzde aktivasyonunu veya NPA ve inhibitör aktiviteyi veya I0'ı hesaplayın. Bu HTS testini göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir ilaç plakası SAC2-34-6170 kullanıldı. HTS, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesinin olduğunu yansıtan 0.7'lik bir Z'faktörü ile mükemmel bir tahlil kalitesine sahipti.
Agonisti ekledikten hemen sonra plakayı okumak önemlidir, çünkü floresan sinyali kısa ömürlüdür. Bu işlemden sonra, tanımlanan isabet molekülü, doz yanıtı testleri ile doğrulanmalı ve hedef dışı vuruşları dışlamak için hedef GPCR'yi ifade etmeyen hücrelerde test edilmelidir.
