Este protocolo demuestra la heterogeneidad en la composición, estructura y morfología de las trampas extracelulares de neutrófilos, dependiendo de su estímulo inductor en condiciones in vitro comparables en neutrófilos humanos de individuos sanos. Se obtiene una alta pureza y viabilidad de neutrófilos. Eso permite comparar la concentración de ADN, LL-37, y la actividad enzimática de la mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G, liberadas por trampas extracelulares de neutrófilos.
Este protocolo permitió analizar el efecto de factores solubles o de contacto celular o posibles terapias o mecanismos de cierre sobre la producción de TNE en enfermedades autoinmunes. Estos métodos pueden ayudar en la investigación de enfermedades autoinmunes. Debido a la reproducción celular incontrolada de los TNE y la duración de la alineación de sus componentes, que se consideran biomarcadores de la enfermedad.
La microscopía de fluorescencia permite capturar imágenes de NET que muestran la dispersión del ADN en asociación con proteínas como LL37, que se co-localizan con microorganismos ayudando a entender cómo están apareciendo. Para comenzar, realice la punción de la vena para recolectar 10 mililitros de sangre periférica en tubos que contienen EDTA dipotásico como anticoagulante. Luego realice una biometría sanguínea estándar y una prueba de proteína C reactiva para descartar una infección o inflamación para garantizar la calidad de la muestra.
Centrifugar la muestra de sangre periférica para eliminar el plasma rico en plaquetas, seguido de una segunda centrifugación y desechar el plasma restante. Diluya el paquete de eritrocitos y leucocitos resultante en una relación de volumen de uno a uno con un DPBS 1X. Luego, en un tubo de vidrio estéril de 10 mililitros, primero deposite un mililitro de solución de densidad de 1.08 gramos por mililitro seguido de un mililitro de solución de densidad de 1.079 gramos por mililitro.
Luego, agregue cuatro mililitros del paquete diluido de eritrocitos y leucocitos vertiendo sobre las paredes. Centrífuga sin aceleración ni desaceleración para evitar perturbar la pendiente. Aspirar la fase correspondiente a los granulocitos y transferir a otro tubo de vidrio estéril de 10 mililitros.
Lavar con cuatro mililitros de 1X DPBS a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Para eliminar los eritrocitos restantes, trate las células con shock osmótico agregando cuatro mililitros de solución salina al 0,2%. Incubar durante dos minutos a cuatro grados centígrados y centrifugar.
Deseche el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de solución salina al 0,65%. Incubar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para restaurar la integridad de la membrana y repetir la centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cuatro mililitros de 1X DPBS para eliminar los desechos celulares.
Nuevamente, centrifugar y volver a suspender el pellet celular en dos mililitros de tampón HBSS frío. Para realizar una prueba de exclusión de azul de tripano, diluir cinco microlitros de la suspensión celular en 20 microlitros de azul de tripano al 0,4%. Cuente las células en una nueva cámara de arco y determine la viabilidad celular mediante una prueba de exclusión.
Luego, monte 5 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos y tiñe con la tinción de Wright durante 15 segundos. Fije inmediatamente la muestra, lávela con agua destilada y observe la morfología bajo un microscopio óptico. A continuación, agregue una vez 10 a las quintas células para fluir tubos de citometría y tiñe con un microlitro de 7AAD en 100 microlitros de tampón FACS durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.
Lavar con 500 microlitros de tampón FACS a 300 G durante 10 minutos. Fijar las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 2% y almacenar a cuatro grados centígrados hasta el análisis de citometría de flujo. Para un control de células muertas, fije las células con 200 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos y lave con 500 microlitros de 1XPBS a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 0.1% Triton X-100. Incubar durante una hora a cuatro grados centígrados. Lavar con 500 microlitros de 1X PBS y manchar con 7AAD.
Analice los datos capturados en el software del citómetro de flujo. Cargue los archivos y haga doble clic en el archivo de neutrófilos sin teñir. Elija dispersión directa o FSC en el eje X y dispersión lateral o SSC en el eje Y para mostrar la población celular correspondiente a los neutrófilos.
Luego seleccione el canal B3-A: PerCP vio 700-A en el eje X para delimitar la autofluorescencia de las células y elija el histograma en el eje Y. Luego, abra el archivo de neutrófilos teñido. Elija FSC en el eje X y SSC en el eje Y para mostrar la población celular correspondiente a los neutrófilos.
De nuevo, seleccione el canal B3-A:PerCP vio 700-A para delimitar la población de neutrófilos positivos para el colorante 7AAD. Genere el histograma final haciendo clic derecho en la ventana y seleccionando copiar al editor de diseño. Agregue pseudohifas bacterianas o fúngicas en microtubos de 1.5 mililitros.
Agregue 200 microlitros, por lo que cinco CFSC micromolares en 1X PBS. Mezclar e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos en la oscuridad. Detenga la reacción agregando 500 microlitros de plasma descomplementado y centrífuga.
Deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de 1XPBS con centrifugación. Luego vuelva a suspender los microorganismos en 250 microlitros de 1X PBS. Preparar alícuotas de 50 microlitros en microtubos de 1,5 mililitros con dos veces 10 a la séptima bacteria o dos veces 10 a la quinta pseudohifas para la inducción NET.
Coloque los resbalones de cubierta de vidrio estéril de 10 por 10 milímetros en una placa de 24 pocillos. Cubrir con 10 microlitros de 0.001% poli l-lisina durante una hora a temperatura ambiente y lavar dos veces con 100 microlitros de 1X PBS. Secar al aire e irradiar con luz UV durante 15 minutos.
A continuación, reemplace la solución HBSS de la suspensión de neutrófilos preparada anteriormente con RPMI 1640 medio suplementado con plasma autólogo descomplementado con calor al 10%. Agregue 350 microlitros de esta suspensión celular a la placa de 24 pocillos para una concentración final de dos veces 10 a la quinta de neutrófilos por pocillo. Incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran al fondo de los pocillos.
Para inducir la formación de redes, agregue los estímulos bacterianos MOI100 y pseudohifas en MOI1. También agregue los estímulos bioquímicos y prepare un control sin estímulo agregando 50 microlitros de HBSS. Obtener un volumen final de 400 microlitros por pocillo y mezclar en un agitador de placas a 140 RPM durante 30 segundos.
Luego incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la inducción neta, retire el sobrenadante de los pocillos pipeteando cuidadosamente y fije las células con 300 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Lave las células con 200 microlitros de 1X PBS sin centrifugar y agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos.
Para la tinción LL37, permeabilizar las células con 200 microlitros de 0,2% Triton X-100 en 1X PBS durante 10 minutos y lavar con 1X PBS dos veces. Monte los deslizamientos de la cubierta en portaobjetos de vidrio. El ADN tiñe las células con dos microlitros de DAPI y se almacenan a menos 20 grados centígrados hasta el análisis por microscopía de fluorescencia confocal.
Las fases celulares dinámicas se visualizaron después de la purificación de gradiente de doble densidad. La morfología típica de neutrófilos se confirmó mediante tinción derecha. Las células también mostraron una viabilidad óptima observada por exclusión de azul de tripano sin interrupción de la membrana.
El análisis de SSC versus FSC por citometría de flujo confirmó una población correspondiente a PMN con alta pureza celular. Los diagramas de puntos PMN para células no teñidas versus células de tinción 7AAD y sus respectivos histogramas indicaron una alta viabilidad celular en los neutrófilos recién aislados en comparación con las células de control permeabilizadas. Después de estimular los neutrófilos con estimulantes químicos y microbianos, los NET fueron visualizados por microscopía de fluorescencia utilizando ADN DPI y anti-LL37.
Los microorganismos fueron pre-teñidos con CFSE. Formación neta suicida inducida por PMA indicada por colocalización con LL37. Mientras que los NET formados con HOCI mostraron una dispersión menor de ADN en el espacio extracelular que correspondía a la formación de NET vital.
NET inducida por pseudohifas fúngicas mostró bajas concentraciones de ADN liberado en el espacio extracelular con estructuras filamentosas características de la formación vital de NET. S.aureus mostró formación vital de NET mientras que P.aeruginosa indujo la liberación de grandes concentraciones de ADN con una morfología turbia que co-localizada con LL37 indicando formación de NET suicida. Realizar la metodología de gradiente de doble densidad nos permite obtener una alta pureza y viabilidad de los neutrófilos.
Y elevamos los lavados, evitamos dañar la estructura de los mismos. Siguiendo este método podemos analizar el efecto de sustancias o células en la producción de NET así como si están implicadas en algún mecanismo o su uso como terapias en enfermedades autoinmunes.
